小鼠胚胎细胞的多路复用单细胞mRNA测序分析

在胚胎发育期间，每个细胞的转录特征因细胞群而异。虽然单分子原位杂交可用于可视化少量基因¹的表达，但单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）提供了一种无偏见的方法来说明单个细胞中基因的全基因组表达模式。自2009^年首次出版以来，scRNA-Seq已应用于研究多个发育阶段的多个组织，在近年^3，4，5。此外，由于人类细胞图集最近启动了以发育为重点的项目，预计在不久的将来将生成更多来自人类胚胎组织的单细胞数据。

心脏作为发育的第一器官在胚胎发育中起着至关重要的作用。心脏由多种细胞类型组成，每种细胞类型的发育在时间和空间上受到严格调控。在过去几年中，心脏细胞在早期发育阶段的起源和细胞系一直以⁶为特征，这为了解先天性心脏病发病机制以及开发更先进的方法刺激心肌细胞再生提供了巨大的有用的导航工具^。

scRNA-Seq在最近几年经历了迅速的扩张，8、9、10。随着新开发的方法，单细胞实验的设计和分析已经变得更加可实现11，12，13，14。这里介绍的方法是基于液滴溶液（见材料表^）15，16的商业程序。该方法在微流体控制系统的控制下，在油水乳液液滴中捕获电池和一组唯一条形码的珠子。细胞加载到液滴的速率极低，因此大多数液滴乳液只含有一个细胞^17。该程序的巧妙设计来自单细胞分离成滴乳液，与条形码同时发生，这使得使用RNA-Seq在异质种群上对单个细胞进行并行分析。

多路复用策略的整合是传统单单元工作流程^13、14的重要补充之一。这种添加在丢弃细胞双子项，降低实验成本，并消除批处理效应^18，19非常有用。基于脂质的条形码策略和基于抗体的条形码策略（见材料表）是两种最常用的多路复用方法。特定条形码用于在这两种方法中标记每个样本，然后混合标记的样本以进行单个单元捕获、库制备和排序。之后，通过分析条形码序列（图1）19，可以分离集合测序数据。但是，这两种方法之间存在显著差异。基于脂质的条形码策略基于脂质修饰寡核苷酸，尚未发现任何细胞类型偏好。而基于抗体的条形码策略只能检测出表达抗原蛋白^{的细胞19、20。}此外，染色脂质大约需要10分钟，而染色抗体需要40分钟（图1）。此外，脂质修饰寡核苷酸比抗体结合的寡核苷酸便宜，但在撰写本文时没有市售。最后，基于脂质的策略可以在一个实验中多路复用96个样本，但基于抗体的策略目前只能多路复用12个样本。

在单个实验中，建议多路复用的细胞数应低于2.5 x 10^4，否则，将导致高百分比的细胞双子数和潜在的环境mRNA污染。通过多路复用策略，单个细胞捕获、cDNA生成和多个样品的库制备成本将降低到一个样本的成本，但测序成本将保持不变。