Combinando microdissecção de captura a laser e qPCR microfluido para analisar perfis transcricional de células únicas: uma abordagem de biologia de sistemas para dependência de opióides
Summary
Este protocolo explica como coletar neurônios únicos, microglia e astrócitos do núcleo central da amígdala com alta precisão e especificidade anatômica usando microdissecção de captura a laser. Além disso, explicamos nosso uso de RT-qPCR microfluido para medir um subconjunto do transcriptome dessas células.
Abstract
A heterogeneidade transcricional profunda em células únicas anatomicamente adjacentes sugere que a funcionalidade robusta do tecido pode ser alcançada pela diversidade de fenótipo celular. Experimentos de células únicas que investigam a dinâmica da rede de sistemas biológicos demonstram respostas celulares e teciduais a várias condições em resolução biologicamente significativa. Aqui, explicamos nossos métodos para coletar células únicas de locais anatomicamente específicos e medir com precisão um subconjunto de seus perfis de expressão genética. Combinamos a microdissecção de captura a laser (LCM) com a transcrição reversa microfluida quantitativa de reações em cadeia de polimerase (RT-qPCR). Também usamos esta plataforma microfluida RT-qPCR para medir a abundância microbiana de conteúdo intestinal.
Introduction
Medir os perfis de expressão genética de células únicas demonstrou extensa heterogeneidade ferotípica dentro de um tecido. Essa complexidade complicou nossa compreensão das redes biológicas que regem a função tecidual. Nosso grupo e outros têm explorado esse fenômeno em muitos tecidos e condições1,2,3,4,5,6. Esses experimentos não apenas sugerem que a regulação das redes de expressão genética sustenta tal heterogeneidade, mas também que a resolução de células únicas revela uma complexidade na função tecidual que a resolução do nível tecidual não aprecia. De fato, apenas uma pequena minoria de células pode responder a uma condição ou desafio específico, mas o impacto dessas células na fisiologia global pode ser substancial. Além disso, uma abordagem de biologia do sistema que aplica métodos multivariados a conjuntos de dados de alta dimensão de vários tipos e tecidos celulares pode elucidar efeitos de tratamento em todo o sistema.
Combinamos LCM e RT-qPCR microfluido para obter tais conjuntos de dados. Nós tomamos esta abordagem aqui em contraste com a coleta de células únicas através da triagem celular ativada por fluorescência (FACS) e usando sequenciamento de RNA (RNA-seq) para medir sua transcrição. A vantagem do LCM sobre o FACS é que a especificidade anatômica exata das células únicas pode ser documentada com LCM, relativamente e absolutamente. Além disso, enquanto o RNA-seq pode medir mais características que RT-qPCR, microfluido RT-qPCR é menos caro e tem uma sensibilidade e especificidade mais elevadas7.
Neste experimento representativo, investigou-se os efeitos da dependência opióide e da retirada de opióides precipitados de naltrexona na expressão genética neuronal, microglia e astrócito de ratos no núcleo central da amígdala (ACE) e da abundância da microflora intestinal4. Foram analisados quatro grupos de tratamento: 1) Placebo, 2) Morfina, 3) Naltrexona e 4) Retirada (Figura 1). Descobrimos que a dependência de opióides não alterou substancialmente a expressão genética, mas essa retirada de opióides induziu a expressão de genes inflamatórios, tnf em particular. Os astrócitos foram o tipo de célula mais afetada. O microbioma intestinal foi profundamente impactado pela retirada de opióides, como indicado por uma diminuição na relação Firmicutes para Bacteroides, que é um marcador estabelecido de disbiose intestinal8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
A biologia unicelular demonstrou a heterogeneidade dos fenótipos celulares e a robustez da função tecidual. Esses achados forneceram insights sobre a organização de sistemas biológicos em escalas macro e micro. Aqui, descrevemos a combinação de dois métodos, LCM e qPCR microfluido, para obter medidas de transcriptome unicelular que fornecem especificidade anatômica e precisão transcricional a um custo relativamente baixo (Figura 1). Nosso grupo adota uma abordagem de biologia de s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho aqui apresentado foi financiado através do NIH HLB U01 HL133360 concedido à JS e RV, NIDA R21 DA036372 concedido à JS e EVB, e T32 AA-007463 concedido a Jan Hoek em apoio à SJO’s.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
Referencias
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- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
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- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
