Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung
Summary
Es wird eine Methode zur Transkription von Getreideprofilen vorgestellt. Das mikroarraybasierte Genexpressionsprofiling beginnt mit der Isolierung hochwertiger Gesamt-RNA aus Getreidekörnern und setzt sich mit der Generierung von cDNA fort. Nach cRNA-Kennzeichnung und Mikroarray-Hybridisierung werden Empfehlungen zur Signalerkennung und Qualitätskontrolle gegeben.
Abstract
Die Charakterisierung der Genexpression hängt von der RNA-Qualität ab. Bei keimenden, entwickelnden und reifen Getreidesamen wird die Extraktion hochwertiger RNA oft durch hohen Stärke- und Zuckergehalt behindert. Diese Verbindungen können sowohl die Ausbeute als auch die Qualität der extrahierten Gesamt-RNA reduzieren. Die Verschlechterung der Quantität und Qualität der gesamten RNA kann sich in der Folge signifikant auf die nachgeschalteten transkriptomischen Analysen auswirken, die möglicherweise nicht genau die räumliche und/oder zeitliche Variation im Genexpressionsprofil der getesteten Proben widerspiegeln. In diesem Protokoll beschreiben wir eine optimierte Methode zur Extraktion von RNA insgesamt mit ausreichender Quantität und Qualität, die für die gesamte Transkriptomanalyse von Getreidekörnern verwendet werden kann. Das beschriebene Verfahren eignet sich für mehrere nachgelagerte Anwendungen, die für die transkriptomische Profilierung von Entwicklungs-, Keim- und reifen Getreidesamen verwendet werden. Die Methode der Transkriptom-Profilierung mit einer Microarray-Plattform wird gezeigt. Diese Methode wurde speziell für die Genexpressionsprofilierung von Getreide mit beschriebenen Genomsequenzen entwickelt. Das detaillierte Verfahren von der Mikroarray-Handhabung bis zur abschließenden Qualitätskontrolle wird beschrieben. Dazu gehören cDNA-Synthese, cRNA-Kennzeichnung, Mikroarray-Hybridisierung, Dia-Scanning, Feature-Extraktion und Datenqualitätsvalidierung. Die mit dieser Methode erzeugten Daten können verwendet werden, um das Transkriptom von Getreide während der Keimung, in verschiedenen Stadien der Kornentwicklung oder unter verschiedenen biotischen oder abiotischen Stressbedingungen zu charakterisieren. Die hier vorgestellten Ergebnisse veranschaulichen hochwertige Transkriptomdaten, die für nachgelagerte Bioinformatik-Analysen zugänglich sind, wie die Bestimmung von differenziell exprimierten Genen (DEGs), die Charakterisierung von Genregulierungsnetzen und die Durchführung einer Transkriptom-weiten Assoziationsstudie (TWAS).
Introduction
Das Transkriptom stellt den vollständigen Satz von Ribonukleinsäure-Transkripten (RNA) dar, die durch das Genom eines Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt und insbesondere umwelt- und Wachstumsbedingungen exprimiert werden. Jede Zelle hat ihr individuelles Transkriptom, das ihren aktuellen physiologischen und metabolischen Zustand widerspiegelt. Eine Sammlung von Zellen, die aus einem ähnlichen Gewebe oder Organ abgeleitet werden, wird in einer typischen Transkriptom-Studie verwendet, aber einzellige und räumlich aufgelöste Transkriptomik wird immer beliebter1. Transkriptomische Analysen beginnen mit der Extraktion der gesamten RNA aus einem ausgewählten Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter definierten Wachstumsbedingungen. Zu diesem Zweck empfehlen wir die Verwendung einer neu entwickelten Methode zur Extraktion von RNA insgesamt aus Proben mit hohem Stärke- oder Zuckergehalt, wie z. B. Getreidesamen2. Der Vergleich von Transkriptomen zwischen verschiedenen Proben führt zur Identifizierung von RNA-Molekülen mit unterschiedlicher Häufigkeit. Diese RNA-Moleküle werden als differenziell exprimierte Gene (DEGs) betrachtet. Die Fülle von Transkripten, die aus bestimmten Markergenen abgeleitet werden, kann dann verwendet werden, um den Entwicklungsstatus abzuschätzen oder die Reaktion eines Organismus auf Umweltschwankungen zu bestimmen. Gene ohne nachweisbare Veränderungen in ihrer Transkriptionüberfluss über die entwicklungsfähigen Zeitpunkte zu studieren werden oft als Referenz oder Housekeeping-Gene verwendet.
Die RNA wird in der Regel durch verschiedene Methoden nachgewiesen und quantifiziert, wie Z.B. Northern Blotting und quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), aber aktuelle Hochdurchsatz-Transkriptomik-Methoden basieren stark auf der Nukleinsäure-Hybridisierung mittels Mikroarray-Technologie sowie DER RNA-Sequenzierung (RNA-Seq). RNA-Seq ist derzeit sehr beliebt, da es mehrere Vorteile für transkriptomische Anwendungen mit hohem Durchsatz bietet, wie an anderer Stelle überprüft3,4. Obwohl eine ältere Technologie, Genexpression Profiling mit Mikroarray-Chips ist immer noch weit verbreitet, weil es eine etablierte Technologie ist, die weniger Hintergrund in der Bioinformatik erfordert. Im Vergleich zu RNA-Seq sind die aus Mikroarray-Experimenten generierten Datensätze kleiner und leichter zu analysieren. Darüber hinaus ist es kostengünstiger, vor allem, wenn es um große Stichprobenzahlen geht. In unserem Labor verwenden wir routinemäßig transkriptomische Analysen mit der Mikroarray-Technologie, um die Rolle zentraler regulatorischer Knotenpunkte zu bestimmen, die die molekularen Netzwerke und Pfade steuern, die am Wachstum, der Entwicklung und dem Stoffwechsel von Getreidekörnern5,6,7,8,9beteiligt sind. Wir verwenden es auch routinemäßig zur Durchführung genomweiter Genexpressions-Profiling-Studien, um ein mechanistisches Verständnis der Reaktion von Getreidekörnern auf abiotische Belastungen zu erhalten10, sowie in der Durchführung von Transkriptom-weiten Assoziations- (TWAS) und Linkage-Mapping-Studien, um Gene zu identifizieren, die für Getreidekornqualität und Ernährung verantwortlich sind11,12. Andere Gruppen haben auch die Mikroarray-Technologie bei der Bereitstellung entwicklungsspezifischer Genexpressionsatlas in Gerste13, Reis14,15,16, Sorghum17und Weizen18verwendet.
Der Zweck dieser Veröffentlichung ist es, eine kurze Textzusammenfassung und eine detaillierte visuelle Beschreibung der Methode zu liefern, die wir derzeit in unserem Labor für die transkriptomische Profilierung von Getreidekörnern mit einer Agilent-Mikroarray-Plattform anwenden. Bitte beachten Sie, dass andere Microarray-Plattformen verfügbar sind, aber nicht von dieser Methode abgedeckt werden. Wir beginnen das Protokoll mit einer detaillierten Beschreibung der RNA-Extraktion aus der Entwicklung oder Keimung von Getreidesamen. Basierend auf unserer Erfahrung ist die Erlangung eines qualitativ hochwertigen und hochmengenreichen Transkriptoms, das für nachgelagerte transkriptomische Analysen zugänglich ist, oft der Engpass bei der Verwendung von Getreidesaatgutgeweben. Wir haben mehrere kommerziell erhältliche RNA-Extraktionskits ausprobiert, aber keines hat zufriedenstellende Ergebnisse geliefert. Daher haben wir ein chemisches Extraktionsprotokoll entwickelt, um einen rohen RNA-Extrakt zu erhalten, der dann mit einem handelsüblichen Kit einer Spaltenreinigung unterzogen wird. Mit dieser Methode erhalten wir routinemäßig und reproduzierbar hochwertige RNA2 (Abbildung 1), die für verschiedene nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden kann, um ein Transkriptomprofil zu erzeugen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebene Methode liefert hochreproduzierbare Ergebnisse für ertragreiche und hochwertige RNA-Extrakte (Abbildung 1). Basierend auf unserer Erfahrung empfehlen wir drei biologische Repliken für einen Genotyp, eine Stufe oder eine Bedingung für die Analyse. Um statistisch bedeutsame Unterschiede erkennen zu können, muss die allgemeine Häufigkeit von mRNA berücksichtigt werden. Bitte beachten Sie jedoch, dass eine Ausgangsmenge von 200 mg Gewebeproben in Triplicaten für den RNA-Extraktionsschritt erforderlich ist. Daher ist diese Methode für Experimente, die eine begrenzte Menge an Proben wie genetisch veränderte Pflanzenmaterialien enthalten, möglicherweise nicht geeignet.
Bei der Mikroarray-Hybridisierung sind die folgenden Schritte am wichtigsten: (1) Das Laden der Proben auf den Dichtungsschlitten (Schritt 4.7) und (2) Waschen der Arrays nach der Hybridisierung (Schritte 4.13 und 4.14). Die Probenbelastung muss sehr sorgfältig durchgeführt werden, um Blasenbildung und Flüssigkeitsaustritt zu vermeiden. Vorsicht ist geboten, wenn der Mikroarrayschlitten auf den Dichtungsschlitten gelegt wird, der die geladenen Proben enthält: Die DNA-Seite (mit gefleckten Sonden) sollte nach unten gerichtet sein, um eine Hybridisierung zu ermöglichen. Für das Waschen der Mikroarrays ist der zweite Waschschritt besonders wichtig: Hier muss das Entfernen der Dias aus Waschpuffer 2 sehr langsam (10 s) durchgeführt werden, um Pufferartefakte auf den Dias zu vermeiden, die die Datenerfassung und -analysen stören können.
Um Ergebnisse aus dem Hybridisierungsexperiment zu erhalten, die für eine abstreamische Bioinformatik-Analyse in Frage kommen, sollte man ein paar wichtige Kriterien befolgen. Der QC-Bericht, der nach der Ausführung des obigen Protokolls generiert wird, gibt eine gute Vorstellung davon, was verbessert werden sollte und welche Daten sich in einem verwendbaren Zustand befinden (Abbildung 3). Die erste erhaltene Information ist das visualisierte Raster (Abbildung 2). Hier kann man direkt sehen, ob alle Bereiche für das Fluoreszenzauslesen richtig ausgerichtet sind. Wenn es eine visuell erkennbare Verschiebung gibt, beeinflusst dies alle anderen Werte (Hintergrund, Signalintensität usw.) und das Auslesen dieses Chips kann nicht verwendet werden. Auf der Übersicht (Räumliche Verteilung aller Ausreißer) kann man leicht Verunreinigungen (z.B. Staub oder Haare) erkennen, die das Ergebnis beeinflusst haben. Schmutz kann durch sanftes Blasen und erneutes Scannen des Chips entfernt werden. Das oben erwähnte Histogramm der Signaldiagramme sollte zu einer breiten Gauß-förmigen Kurve mit nur geringfügigen Ausreißern führen (Abbildung 2). Je nach analysiertem Gewebe(Abbildung 1)kann diese Kurve unterschiedlich aussehen und zwei Spitzen oder einen vorherrschenden Peak mit einer Schulter aufweisen. Diequalität der Daten wird dadurch nicht beeinflusst. Nur ein stark verschobener Peak oder hohe Signale an den Rändern weisen auf Probleme hin, wie z. B. “grüne Monster” (zu hohe Fluoreszenzintensitäten), die nicht durch Waschen entfernt werden können und dem Chiphersteller gemeldet werden sollten. Außerdem sollte das “Spatial Distribution Graph for Median Signals” um einen gemeinsamen Wert herum variieren. Dies sollte im Bereich zwischen 40 und 100 liegen, abhängig von der allgemeinen Intensitätsauslesung des analysierten Chips. Eine weitere wichtige Qualitätskontrolle ist die Auswertung der Datenspitze: Der Loggraph für die Signalspitze sollte zu einer linearen und regulären Linie führen. Schließlich gibt die Tabelle der “Evaluierungsmetriken” einen guten und zuverlässigen Überblick über die erhaltenen Ergebnisse. Hier stellt der Hersteller eine Reihe von Werten zur Verfügung, die als Ausgezeichnet, Gut und Bewerten klassifiziert werden können (Abbildung 3). Nach unserer Erfahrung können einige der Werte nicht immer für alle Chips angewendet werden. Bei kundenspezifischen Reischips lag der “NonControl-Wert” häufig aneben, hat aber keinen wesentlichen Einfluss auf die weitere Datenverarbeitung. Darüber hinaus könnte der Bereich für “NegControl” auf der Grundlage von Gewebe, Organismus und allgemeiner Leistung des Chips auf <80 erweitert werden. Der Bereich für die Auswertung für den Wert E1 med CV kann nach unserer Erfahrung auf <9 statt auf <8 erweitert werden. Danach ist eine ordnungsgemäße Auswertung aller ausgelesenen Chipdaten möglich. Im Allgemeinen sollte man immer im Hinterkopf behalten, dass unabhängige biologische Repliken immer das zuverlässigste Ergebnis ergeben.
Der Vorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden liegt in der Tatsache, dass sie eine kostengünstige, hochdurchsatzbasierte Methode für die Transkriptionsprofilierung darstellt. Darüber hinaus ist die nachgelagerte Datenanalyse-Pipeline einfacher und etablierter. Trotz Der Vorteile gibt es gewisse Einschränkungen dieser Technik, wie z. B. die Anzahl der Gene, die analysiert werden können. Das Mikroarray kann nur die Analyse von Genen erleichtern, die zuvor auf dem Array gesichtet wurden. Daher ist diese Technik nur auf Pflanzenarten mit sequenzierten Genomen und vollständig benoteten Genen anwendbar. Wir gehen davon aus, dass die mikroarraybasierte Transkriptomik weiterhin sehr nützlich und relevant sein wird, nicht nur für das Profiling von Genexpression, sondern auch für andere nachgelagerte Bioinformatik-Pipelines wie Gen-Regulierungsnetzwerkanalysen und Transkriptom-weite Assoziationsstudien.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde im Rahmen des CGIAR-Themenbereichs Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III und IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Deutschland, unterstützt. Wir danken Mandy Püffeld für ihre hervorragende technische Unterstützung und Dr. Isabel Maria Mora-Ramirez für den Austausch von Informationen und Erfahrungen mit dem Weizenchip. Wir danken Dr. Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Deutschland) für die Kommentare und die kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Roth | 4227.3 | Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | To determine quality and quantity of RNA extract | |
| Crushed ice maker | Various brands | To keep samples on ice during sample processing | |
| Dewar flask | Various brands | Used as liquid nitrogen container | |
| Ethanol, absolute | Roth | 9065.1 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | Kit components: 2X Hi-RPM Hybridization Buffer 25X Fragmentation Buffer 10X Gene Expression Blocking Agent |
| Gene Expression Wash buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5325 | Kit components: Gene Expression Wash Buffer 1 Gene Expression Wash Buffer 2 Triton X-102 |
| Heat block | Various brands | It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight. |
| Hybridization gasket slide kit | Agilent | G2534-60014 | |
| iQAir air cleaner | To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area | ||
| Isopropanol | Roth | 9866.5 | |
| Lint-free paper, Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | KC34155 | |
| Low Input Quick Amp Labeling Kit | Agilent Technologies | 5190-2305 | Kit components: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Nuclease-free water Cyanine 3-CTP |
| Metal spatula, small | Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples. | ||
| Microarray scanner | Agilent Technologies | Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended | |
| Microfuge tubes, nuclease-free | Various brands | 2.0 mL and 1.5 mL volume | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5810 R | It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes |
| Mini incubator | Labnet | I5110-230V | Any small incubator will do. |
| Mortar and pestle | Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen. | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Nanodrop 1000 | Peqlab / Thermofisher | ||
| Nuclease-free water | Biozym | 351900302 | |
| One-Color RNA Spike-In Kit | Agilent | 5188-5282 | Kit components: One color RNA Spike-Mix Dilution Buffer |
| Ozone barrier slide cover kit | Agilent | G2505-60550 | Optional but highly recommended |
| PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
| Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Pipette tips, nuclease free, filter tips | Various brands | To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
| Pipettor set | Various brands | For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
| RNA Extraction Buffer | 10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 ul/mL β-mercaptoethanol |
We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily | |
| RNase-free DNase set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RW Buffer RPE Nuclease-free water |
| RNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 74904 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) QIAshredder spin column (purple) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RLC Buffer RW1 Buffer RPE Nuclease-free water |
| Slide holders for DNA microarray scanner | Agilent | G2505-60525 | |
| Slide staining dish with removable rack | DWK Life Sciences 900200 | Fisher Scientific 08-812 | We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack) |
| Sodium chloride | Roth | P029.1 | |
| Ultralow temperature freezer | Various brand | Capable of storing sample at -80 °C | |
| Vortex mixer | Various brands | At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes |
Referencias
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