الحصول على بيانات النسخ عالية الجودة من بذور الحبوب من خلال طريقة معدلة لتنميط التعبير الجيني
Summary
يتم تقديم طريقة لتنميط النسخ من الحبوب. يبدأ التنميط الجيني للتعبير عن الفوضى الدقيقة مع عزل الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من حبوب الحبوب ويستمر مع توليد cDNA. بعد وضع العلامات cRNA وmicroarray التهجين، يتم تقديم توصيات للكشف عن الإشارات ومراقبة الجودة.
Abstract
يعتمد توصيف التعبير الجيني على جودة الحمض النووي الريبي. في الإنبات، وبذور الحبوب النامية والناضجة، وغالبا ما يعوق استخراج الحمض النووي الريبي عالية الجودة من قبل ارتفاع محتوى النشا والسكر. يمكن لهذه المركبات تقليل كل من العائد وجودة الحمض النووي الريبي الكلي المستخرج. ويمكن أن يكون للتدهور في كمية ونوعية مجموع الحمض النووي الريبي أثر كبير في وقت لاحق على التحليلات الالنسخية في المصب، التي قد لا تعكس بدقة التباين المكاني و/أو الزمني في ملف التعبير الجيني للعينات التي يجري اختبارها. في هذا البروتوكول، ونحن نصف طريقة الأمثل لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي مع كمية كافية ونوعية لاستخدامها في تحليل النسخ الكامل من الحبوب. الطريقة الموصوفة مناسبة للعديد من تطبيقات المصب المستخدمة في التنميط النسخي للبذور الحبوب النامية والإنبات والناضجة. يتم عرض طريقة التنميط transcriptome باستخدام منصة microarray. تم تصميم هذه الطريقة خصيصا لتنميط التعبير الجيني للحبوب مع تسلسل الجينوم الموصوفة. يتم وصف الإجراء التفصيلي من معالجة microarray إلى مراقبة الجودة النهائية. وهذا يشمل تركيب cDNA ، cRNA الوسم ، التهجين microarray ، مسح الشرائح ، استخراج الميزات ، والتحقق من جودة البيانات. يمكن استخدام البيانات الناتجة عن هذه الطريقة لتوصيف النسخ من الحبوب أثناء الإنبات ، في مراحل مختلفة من تطور الحبوب ، أو في ظروف الإجهاد الحيوي أو اللاأحيائي المختلفة. النتائج المعروضة هنا مثال على بيانات النسخ عالية الجودة القابلة لتحليلات المعلوماتية الحيوية في المصب ، مثل تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) ، وتوصيف الشبكات التنظيمية للجينات ، وإجراء دراسة الارتباط على نطاق النسخ (TWAS).
Introduction
يمثل النسخ مجموعة كاملة من النصوص الحمض النووي الريبي (RNA) التي أعرب عنها جينوم كائن حي في وقت معين وخاصة الظروف البيئية والنمو. كل خلية لها transcriptome الفردية، والتي تعكس حالتها الفسيولوجية والأيضية الحالية. يتم استخدام مجموعة من الخلايا المشتقة من نسيج أو عضو مماثل في دراسة النسخ النموذجية ، ولكن الخلايا المفردة والخلايا المصممة مكانًا هي الحصول على شعبية1. تبدأ التحليلات الكجنية باستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من نسيج محدد في نقطة زمنية محددة ، وفي ظروف نمو محددة. لهذا الغرض، ونحن نوصي باستخدام طريقة وضعت حديثا لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي من عينات عالية في محتوى النشا أو السكر، مثل بذور الحبوب2. المقارنة بين النسخ بين عينات مختلفة النتائج في تحديد جزيئات الحمض النووي الريبي مع وفرة مختلفة. وتعتبر هذه الجزيئات الحمض النووي الريبي الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs). ويمكن بعد ذلك استخدام وفرة النصوص المستمدة من جينات علامات محددة لتقدير الحالة الإنمائية أو تحديد استجابة الكائن الحي للتقلبات البيئية. الجينات مع عدم وجود تغييرات يمكن الكشف عنها في وفرة النص عبر النقاط الزمنية التنموية قيد الدراسة وغالبا ما تستخدم كمرجع أو جينات التدبير المنزلي.
يتم الكشف عن الحمض النووي الريبي عادة وكميا من قبل أساليب مختلفة، مثل النشاف الشمالي وكمية عكس البلياز تفاعل البوليميراز (qRT-PCR)، ولكن الأساليب الحالية النسخ عالية الإنتاجية تعتمد بشكل كبير على التهجين الحمض النووي باستخدام تكنولوجيا microarray فضلا عن تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq). RNA-Seq تحظى بشعبية كبيرة في الوقت الحاضر لأنه يوفر العديد من المزايا لتطبيقات النسخ عالية الإنتاجية كما استعرضت في مكان آخر3,4. على الرغم من أن التكنولوجيا القديمة ، والتنميط التعبير الجيني باستخدام رقائق microarray لا تزال تستخدم على نطاق واسع لأنها تكنولوجيا أكثر راسخة ، والتي تتطلب أقل من خلفية في المعلوماتية الحيوية. بالمقارنة مع RNA-Seq ، فإن مجموعات البيانات الناتجة عن تجارب microarray أصغر وأسهل في التحليل. وبالإضافة إلى ذلك، فمن أكثر فعالية من حيث التكلفة، وخاصة إذا كان التعامل مع أعداد كبيرة من العينة. في مختبرنا، نستخدم بشكل روتيني التحليلات النسخة باستخدام تكنولوجيا microarray لتحديد دور المحاور التنظيمية المركزية التي تحكم الشبكات الجزيئية والمسارات المشاركة في نمو وتطوير واستقلاب الحبوب5،6،7،8،9. كما نستخدمها بشكل روتيني لإجراء دراسات توصيف التعبير الجيني على نطاق الجينوم للحصول على فهم ميكانيكي لاستجابة حبوب الحبوب للضغوط اللاأحيائية10، وكذلك في إجراء الارتباط على نطاق النسخ (TWAS) ودراسات رسم خرائط الروابط لتحديد الجينات المسؤولة عن جودة الحبوب الحبوب والتغذية11،12. كما استخدمت مجموعات أخرى تكنولوجيا الصفيف الصغير في توفير أطلس التعبير الجيني الخاص بالتنمية في الشعير13والأرز14و15,,و16والذرة الرفيعة17والقمح18.
الغرض من هذا المنشور هو تقديم ملخص نصي موجز ووصف مرئي مفصل للطريقة التي نستخدمها حاليًا في مختبرنا للتنميط النسخي لحبوب الحبوب باستخدام منصة Agilent microarray. يرجى ملاحظة أن منصات microarray الأخرى متوفرة، ولكن لن يتم تغطيتها في هذه الطريقة. نبدأ البروتوكول من خلال تقديم وصف مفصل لاستخراج الحمض النووي الريبي من تطوير أو إنبات بذور الحبوب. استنادا إلى تجربتنا، والحصول على نسخة عالية الجودة وكمية عالية قابلة لتحليلات النسخ المصب غالبا ما يكون عنق الزجاجة عند استخدام أنسجة بذور الحبوب. لقد جربنا العديد من مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريًا ، ولكن لم يقدم أي منها نتائج مرضية. ومن ثم، قمنا بتطوير بروتوكول استخراج كيميائي للحصول على مستخلص الحمض النووي الريبي الخام الذي يخضع بعد ذلك لتنقية الأعمدة باستخدام مجموعة متاحة تجاريا. باستخدام هذه الطريقة، ونحن بشكل روتيني واستنساخ الحصول على جودة عالية الحمض النووي الريبي2 (الشكل 1)،والتي يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مختلفة لتوليد ملف تعريف transcriptome.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر الطريقة الموصوفة نتائج قابلة للتكرار للغاية لمستخلصات الحمض النووي الريبي عالية الغلة وعالية الجودة(الشكل 1). بناء على خبرتنا، نوصي بثلاث نسخ بيولوجية لنمط جينوواحد أو مرحلة أو شرط للتحليل. لتكون قادرة على الكشف عن الاختلافات ذات مغزى إحصائيا، يجب النظر في وفرة عامة من مرنا. ومع ذلك، يرجى ملاحظة أن كمية تبدأ من 200 عينات من أنسجة ملغ مطلوبة في ثلاثية العينات لخطوة استخراج الحمض النووي الريبي. وبالتالي، بالنسبة للتجارب التي تحتوي على كمية محدودة من العينات مثل المواد النباتية المعدلة وراثيا، قد لا تكون هذه الطريقة مناسبة.
أثناء التهجين الجزئي، الخطوات التالية هي الأكثر أهمية: (1) تحميل العينات إلى شريحة طوقا (الخطوة 4.7) و (2) غسل الصفائف بعد التهجين (الخطوتان 4.13 و 4.14). تحميل عينة يحتاج إلى القيام به بعناية فائقة لتجنب تشكيل فقاعة وتسرب السائل. الحذر ضروري عند وضع شريحة microarray على شريحة طوقا التي تحتوي على العينات المحملة: يجب أن يواجه جانب الحمض النووي (مع المسابير المرقطة) لأسفل للسماح بالتهجين. لغسل الفوضى الدقيقة ، فإن خطوة الغسيل الثانية أمر بالغ الأهمية : هنا ، يجب إجراء إزالة الشرائح من الغسيل المؤقت 2 ببطء شديد (10 ثوان) لتجنب القطع الأثرية العازلة على الشرائح ، والتي يمكن أن تتداخل مع الحصول على البيانات والتحليلات.
وبغية الحصول على نتائج من تجربة التهجين المؤهلة لتحليل المعلوماتية البيولوجية في المصب، ينبغي اتباع بعض المعايير الهامة. تقرير مراقبة الجودة، الذي يتم إنشاؤه بعد أداء البروتوكول أعلاه، يعطي فكرة جيدة عما ينبغي تحسينه، والبيانات التي هي في حالة قابلة للاستخدام(الشكل 3). المعلومات الأولى الواردة هي الشبكة المتخيلة(الشكل 2). هنا ، يمكن للمرء أن يرى مباشرة ما إذا كانت جميع المناطق لقراءة الفلورسين ستتماشى بشكل صحيح. إذا كان هناك تحول يمكن الكشف عنه بصرياً، سيؤثر هذا على جميع القيم الأخرى (الخلفية، شدة الإشارة، إلخ) ولا يمكن استخدام قراءة هذه الشريحة. على نظرة عامة (التوزيع المكاني لجميع القيم المتطرفة)، يمكن للمرء بسهولة بقعة أي تلوث (مثل الغبار أو الشعر)، والتي أثرت على النتيجة. يمكن إزالة الأوساخ عن طريق تهب بهدوء وrescanning رقاقة. يجب أن يؤدي الرسم البياني لمؤامرة الإشارة كما ذكر أعلاه إلى منحنى واسع على شكل غاوس ، مع القيم المتطرفة الصغيرة فقط(الشكل 2). اعتمادا على الأنسجة التي تم تحليلها(الشكل 1)، يمكن أن يبدو هذا المنحنى مختلفًا ويمكن أن يبدو أن له قمتين ، أو قمة سائدة واحدة مع الكتف. وهذا لن يؤثر على نوعية البيانات. فقط ذروة تحول قوية، أو إشارات عالية على حواف تشير إلى مشاكل، مثل “الوحوش الخضراء” (كثافة الفلورسان عالية جدا)، والتي لا يمكن إزالتها عن طريق الغسيل وينبغي الإبلاغ عنها إلى الشركة المصنعة رقاقة. كما ينبغي أن يختلف “الرسم البياني للتوزيع المكاني للإشارات الوسيطة” حول قيمة مشتركة. وينبغي أن يكون هذا في نطاق بين 40 و 100، اعتمادا على قراءة كثافة عامة من رقاقة تحليلها. مراقبة نوعية هامة أخرى هي تقييم الارتفاع في البيانات: يجب أن يؤدي الرسم البياني للإشارة إلى خط خطي ومنتظم. وأخيرا، فإن جدول “مقاييس التقييم” يعطي رؤية جيدة وموثوقة للنتائج الواردة. هنا الشركة المصنعة يوفر مجموعة من القيم التي يمكن تصنيفها على أنها ممتازة، جيدة وتقييم(الشكل 3). وفقا لتجربتنا، لا يمكن دائما تطبيق بعض القيم لجميع رقائق. بالنسبة لرقائق الأرز المخصصة، كانت “قيمة عدم التحكم” في كثير من الأحيان خارج النطاق ولكنها لا تؤثر بشكل كبير على معالجة البيانات الإضافية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم توسيع نطاق “NegControl” ، استنادًا إلى الأنسجة والكائنات الحية والإخراج العام للرقاقة إلى <80. قد يتم توسيع نطاق التقييم لقيمة E1 Med CV إلى < 9 ، بدلاً من < 8 وفقًا لتجربتنا. بعد ذلك ، من الممكن إجراء تقييم مناسب لجميع البيانات التي تُقرأ. بشكل عام ، يجب على المرء أن يضع في اعتبارك دائمًا أن النسخ البيولوجي المستقل يعطي دائمًا النتيجة الأكثر موثوقية.
وتكمن ميزة هذه التقنية مقارنة بأساليب أخرى في حقيقة أنها تمثل طريقة فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية للتنميط النسخي. وعلاوة على ذلك، فإن خط أنابيب تحليل البيانات في المصب أسهل وأكثر تحديدًا. على الرغم من المزايا ، هناك بعض القيود على هذه التقنية ، مثل عدد الجينات التي يمكن تحليلها. يمكن للميكرورفير فقط تسهيل تحليل الجينات التي رصدت سابقا تحقيقات على الصفيف. ولذلك، فإن هذه التقنية لا تنطبق إلا على الأنواع النباتية ذات الجينوم المتسلسل والجينات المشروحة بالكامل. ونحن نتصور أن النسخ القائمة على الصفيفات الصغيرة ستظل مفيدة جدا وذات صلة ليس فقط لتنميط التعبير الجيني ولكن أيضا لخطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية الأخرى في المصب مثل تحليلات الشبكة التنظيمية الجينية ودراسة الارتباط على نطاق النسخ.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل في إطار المجال المواضيعي للمجموعة الاستشارية للبحوث الزراعية في مجال الأغذية الزراعية من أجل الأغذية CRP، والأرز، والأرز المتسامح مع الإجهاد لأفريقيا وجنوب آسيا، والمرحلة الثالثة من البرنامج، والمركز المتعدد التخصصات لبحوث نباتات المحاصيل، هالي (سال)، ألمانيا. نشكر ماندي بوفيلد على مساعدتها التقنية الممتازة والدكتورة إيزابيل ماريا مورا راميريز على تبادل المعلومات والخبرات مع رقاقة القمح. نشكر الدكتورة روندا ماير (RG Heterosis, IPK Gatersleben, ألمانيا) على تعليقاتها وقراءتها النقدية للمخطوطة.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Roth | 4227.3 | Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | To determine quality and quantity of RNA extract | |
| Crushed ice maker | Various brands | To keep samples on ice during sample processing | |
| Dewar flask | Various brands | Used as liquid nitrogen container | |
| Ethanol, absolute | Roth | 9065.1 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | Kit components: 2X Hi-RPM Hybridization Buffer 25X Fragmentation Buffer 10X Gene Expression Blocking Agent |
| Gene Expression Wash buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5325 | Kit components: Gene Expression Wash Buffer 1 Gene Expression Wash Buffer 2 Triton X-102 |
| Heat block | Various brands | It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight. |
| Hybridization gasket slide kit | Agilent | G2534-60014 | |
| iQAir air cleaner | To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area | ||
| Isopropanol | Roth | 9866.5 | |
| Lint-free paper, Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | KC34155 | |
| Low Input Quick Amp Labeling Kit | Agilent Technologies | 5190-2305 | Kit components: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Nuclease-free water Cyanine 3-CTP |
| Metal spatula, small | Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples. | ||
| Microarray scanner | Agilent Technologies | Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended | |
| Microfuge tubes, nuclease-free | Various brands | 2.0 mL and 1.5 mL volume | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5810 R | It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes |
| Mini incubator | Labnet | I5110-230V | Any small incubator will do. |
| Mortar and pestle | Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen. | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Nanodrop 1000 | Peqlab / Thermofisher | ||
| Nuclease-free water | Biozym | 351900302 | |
| One-Color RNA Spike-In Kit | Agilent | 5188-5282 | Kit components: One color RNA Spike-Mix Dilution Buffer |
| Ozone barrier slide cover kit | Agilent | G2505-60550 | Optional but highly recommended |
| PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
| Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Pipette tips, nuclease free, filter tips | Various brands | To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
| Pipettor set | Various brands | For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
| RNA Extraction Buffer | 10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 ul/mL β-mercaptoethanol |
We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily | |
| RNase-free DNase set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RW Buffer RPE Nuclease-free water |
| RNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 74904 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) QIAshredder spin column (purple) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RLC Buffer RW1 Buffer RPE Nuclease-free water |
| Slide holders for DNA microarray scanner | Agilent | G2505-60525 | |
| Slide staining dish with removable rack | DWK Life Sciences 900200 | Fisher Scientific 08-812 | We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack) |
| Sodium chloride | Roth | P029.1 | |
| Ultralow temperature freezer | Various brand | Capable of storing sample at -80 °C | |
| Vortex mixer | Various brands | At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes |
Referencias
- Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), (2018).
- Püffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform. Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).
- Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. Catalyzing plant science research with RNA-seq. Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).
- Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. RNA-Seq methods for transcriptome analysis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
- Radchuk, V. V., et al. Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain. Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).
- Sreenivasulu, N. Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination. Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).
- Sreenivasulu, N., Wobus, U. Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots. Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).
- Butardo, V. M., et al. Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis. Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).
- de Guzman, M. K., et al. Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination. Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).
- Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress. Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).
- Anacleto, R., et al. Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
- Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling. BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).
- Druka, A., et al. An atlas of gene expression from seed to seed through barley development. Functional & Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).
- Fujita, M., et al. Rice Expression Atlas In Reproductive Development. Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).
- Wang, L., et al. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice. The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).
- Yamakawa, H., Hakata, M. Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).
- Shakoor, N., et al. A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums. BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).
- Yu, Y. L., et al. Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development. Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).
- Kochevenko, A., et al. Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress. BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).
