Получение высококачественных транскриптомных данных из зерновых семян с помощью модифицированного метода профилирования экспрессии генов
Summary
Представлен метод транскриптомного профилирования зерновых. Профилирование экспрессии генов на основе микроаррей начинается с изоляции высококачественной тотальной РНК от зерновых зерен и продолжается с генерацией кДНК. После маркировки cRNA и гибридизации микроаррей даются рекомендации по обнаружению сигналов и контролю качества.
Abstract
Характеристика экспрессии генов зависит от качества РНК. При прорастании, развитии и созревании семян зерновых добыче высококачественной РНК часто препятствует высокое содержание крахмала и сахара. Эти соединения могут снизить как урожайность, так и качество извлекаемых РНК. Ухудшение количества и качества общей РНК может впоследствии оказать значительное влияние на транскриптомический анализ вниз по течению, который может не точно отражать пространственные и/или временные изменения в профиле экспрессии генов тестируемых образцов. В этом протоколе мы описываем оптимизированный метод извлечения общей РНК с достаточным количеством и качеством, который будет использоваться для анализа цельного транскриптома зерновых культур. Описанный метод подходит для нескольких вниз по течению приложений, используемых для транскриптомического профилирования развивающихся, прорастание, и зрелые семена зерновых. Показан метод профилирования транскриптома с помощью платформы microarray. Этот метод специально разработан для профилирования экспрессии генов зерновых с описанными последовательностями генома. Описана подробная процедура от обработки микроаррей до окончательного контроля качества. Это включает в себя синтез кДНК, маркировку cRNA, гибридизацию микроаррей, сканирование слайдов, извлечение функций и проверку качества данных. Данные, генерируемые этим методом, могут быть использованы для характеристики транскриптома зерновых во время прорастания, на различных стадиях развития зерна, или в различных биотических или абиотических условиях стресса. Представленные здесь результаты иллюстрируют высококачественные транскриптомные данные, поддающиеся анализу биоинформатики, таким как определение дифференциально выраженных генов (DEGs), характеристика сетей регулятивного гена и проведение исследования ассоциации в масштабах транскриптома (TWAS).
Introduction
Транскриптом представляет собой полный набор рибонуклеиновой кислоты (РНК) стенограммы, выраженные генома организма в данный момент времени и, в частности, экологических и условий роста. Каждая клетка имеет свою индивидуальную транскриптом, которая отражает ее текущее физиологичебное и метаболическое состояние. Коллекция клеток, полученных из аналогичных тканей или органов используется в типичном исследовании транскриптома, но одноклеточные и пространственно-решенной транскриптомики становятся популярными1. Транскриптомический анализ начинается с извлечения общей РНК из выбранной ткани в определенный момент времени и в определенных условиях роста. Для этого мы рекомендуем использовать недавно разработанный метод извлечения общей РНК из образцов с высоким содержанием крахмала или сахара, таких как семена зерновых2. Сравнение транскриптомов между различными образцами приводит к идентификации молекул РНК с разным изобилием. Эти молекулы РНК считаются дифференциально выраженными генами (DEGs). Обилие транскриптов, полученных из конкретных генов маркеров, может затем использоваться для оценки состояния развития или определения реакции организма на колебания окружающей среды. Гены без обнаруживаемых изменений в их изобилии транскрипта через изыскивая времени развития часто использованы как справка или гены housekeeping.
РНК, как правило, обнаруживается и количественно определяется различными методами, такими как северная blotting и количественная обратная транскриптаза полимеразной цепной реакции (qRT-PCR), но нынешние методы транскриптомики высокой пропускной способности в значительной степени опираются на гибридизацию нуклеиновой кислоты с использованием технологии микроаррейка, а также секвенирования РНК (RNA-Seq). RNA-Seq очень популярен в настоящее время, поскольку он предоставляет несколько преимуществ для высокой пропускной транскриптомической приложений, как рассмотрены в другом месте3,4. Хотя более старая технология, профилирование экспрессии генов с использованием микросхем микросхем по-прежнему широко используется, потому что это более устоявшаяся технология, которая требует меньше фона в биоинформатике. По сравнению с RNA-Seq наборы данных, полученные в результате экспериментов на микроархе, меньше и их легче анализировать. Кроме того, он является более рентабельным, особенно если речь идет о больших числах выборки. В нашей лаборатории мы регулярно используем транскриптомические анализы с использованием технологии microarray для определения роли центральных регуляторных центров, которые регулируют молекулярные сети и пути, участвующие в росте, развитии и метаболизме зерновых5,6,7,8,9. Мы также регулярно использовать его для проведения генома всей генной экспрессии профилирования исследований для получения механистического понимания реакции зерновых зерновых на абиотических стрессов10, а также в проведении транскриптома всей ассоциации (TWAS) и ссылка картографических исследований для выявления генов, ответственных за качество зерновых зерна и питания11,12. Другие группы также использовали технологию microarray в обеспечении разработки конкретных атлас экспрессии генов в ячмень13, рис14,15,16, сорго17, и пшеница18.
Цель юга состоит в том, чтобы предоставить краткое текстовое резюме и подробное визуальное описание метода, который мы в настоящее время используем в нашей лаборатории для транскриптомического профилирования зерновых с использованием платформы Agilent microarray. Обратите внимание, что другие платформы microarray доступны, но не будут охвачены этим методом. Мы начинаем протокол с представления подробного описания извлечения РНК из развивающихся или прорастающих семян зерновых. Основываясь на нашем опыте, получение высококачественного и высокого количества транскриптома поддается вниз по течению транскриптомического анализа часто является узким местом при использовании тканей семян зерновых. Мы пробовали несколько коммерчески доступных комплектов извлечения РНК, но ни один из них не дал удовлетворительных результатов. Таким образом, мы разработали протокол химической добычи для получения сырой экстрактА РНК, который затем подвергается очистке колонки с помощью коммерчески доступного комплекта. Используя этот метод, мы регулярно и воспроизводим получать высокое качество РНК2 (Рисунок 1), которые могут быть использованы для различных приложений вниз по течению для создания профиля транскриптома.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный метод обеспечивает высоковоспроизводимые результаты для высокодоходных и высококачественных экстрактов РНК(рисунок 1). Основываясь на нашем опыте, мы рекомендуем три биологические репликации для одного генотипа, стадии или условия для анализа. Чтобы быть в состоянии обнаружить статистически значимые различия, общее изобилие мРНК должны быть рассмотрены. Пожалуйста, обратите внимание, однако, что начальное количество 200 мг образцов ткани требуется в трипликидляы для шага экстракции РНК. Следовательно, для экспериментов, которые имеют ограниченное количество образцов, таких как генетически модифицированные растительные материалы, этот метод может быть неуместным.
При гибридизации микроаррей наиболее важны следующие шаги: (1) загрузка образцов на горку прокладки (Шаг 4.7) и (2) промывание массивов после гибридизации (Шаги 4.13 и 4.14). Загрузка образцов должна быть сделана очень тщательно, чтобы избежать образования пузырьков и разлива жидкости. Осторожность необходима при размещении microarray слайд на прокладке слайд, содержащий загруженные образцы: ДНК-стороне (с пятнистыми зондами) должны быть лицом вниз, чтобы гибридизации. Для мытья микроаррей, второй шаг мытья особенно критично: здесь, удаление слайдов из буфера мытья 2 должно быть выполнено очень медленно (10 с), чтобы избежать буфера артефактов на слайдах, которые могут помешать сбору данных и анализу.
Для того, чтобы получить результаты эксперимента по гибридизации, которые имеют право на анализ биоинформатики ниже потока, следует следовать нескольким важным критериям. Отчет КК, который генерируется после выполнения вышеуказанного протокола, дает хорошее представление о том, что должно быть улучшено, а какие данные находятся в пригодном для использования состоянии(рисунок 3). Первая полученная информация является визуализированной сетки(рисунок 2). Здесь можно сразу увидеть, если все области для флуоресценции считывания правильно выровнены. При визуальном сдвиге это повлияет на все другие значения (фон, интенсивность сигнала и т.д.), и считывание этого чипа не может быть использовано. На обзоре (пространственное распределение всех выбросов) можно легко обнаружить любое загрязнение (например, пыль или волосы), которое повлияло на результат. Грязь может быть удалена путем мягкого дует и повторного сканирования чипа. Гистограмма сигнального участка, как упоминалось выше, должна привести к широкой кривой в форме Гаусса, и только незначительные выбросы (Рисунок 2). В зависимости от ткани проанализированы (Рисунок 1), эта кривая может выглядеть по-разному и может появиться иметь два пика, или один преобладающий пик с плечом. Это не повлияет на качество данных. Только сильный сдвинутый пик, или высокие сигналы по краям указывают на проблемы, такие как “зеленые монстры” (слишком высокая интенсивность флуоресценции), которые не могут быть удалены путем стирки и должны быть доведены до сведения производителя чипов. Кроме того, “График пространственного распределения для медианных сигналов” должен меняться вокруг общего значения. Это должно быть в диапазоне от 40 до 100, в зависимости от общей интенсивности считывания чипа проанализированы. Другим важным контролем качества является оценка всплеска данных: журнал-график для всплеска сигналов должен привести к линейной и регулярной линии. Наконец, таблица “метрики оценки” дает хорошее и надежное представление о полученных результатах. Здесь производитель предоставляет ряд значений, которые могут быть классифицированы как Отлично, Хорошо и оценить(рисунок 3). Согласно нашему опыту, некоторые ценности не всегда могут быть применены ко всем фишкам. Для чипсов, изготовленных на заказ риса, “неконтрольное значение” часто выходило из диапазона, но не оказывает существенного влияния на дальнейшую обработку данных. Кроме того, диапазон для “NegControl” может быть расширен, на основе ткани, организма и общего выхода чипа до злт;80. Диапазон для оценки значения E1 med CV может быть расширен до злт;9, а не lt;8 в соответствии с нашим опытом. После этого возможна надлежащая оценка всех данных, зачитаных чипами. В общем, всегда следует иметь в виду, что независимые биологические репликации всегда дают самый надежный результат.
Преимущество этого метода по сравнению с другими методами заключается в том, что он представляет собой экономически эффективный, высокопроизводительный метод транскрипционного профилирования. Кроме того, конвейер анализа данных ниже по течению проще и установиться. Несмотря на преимущества, существуют определенные ограничения этой техники, такие как количество генов, которые могут быть проанализированы. Микроаррей может только облегчить анализ генов, ранее замеченных зондов на массиве. Таким образом, этот метод применим только к видам растений с секвенированными геномами и полностью аннотированными генами. Мы предусматриваем, что транскриптомика на основе микроаррей будет по-прежнему очень полезной и актуальной не только для профилирования экспрессии генов, но и для других трубопроводов биоинформатики, таких как анализ регулятивной сети генов и исследование ассоциации в масштабах всей транскриптома.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана в рамках ТЕМАТической области CGIAR Глобальная рисовая агропродовольственная система CRP, RICE, стрессоустойчивый рис для Африки и южной Азии (STRASA) Фаза III, и ИзН (Междисциплинарный центр исследований растениеводства, Галле (Сале), Германия. Мы благодарим Мэнди Пюффельд за отличную техническую помощь и д-ра Изабель Марию Мора-Рамирес за обмен информацией и опытом с помощью пшеничного чипа. Мы благодарим доктора Ронду Мейер (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Германия) за комментарии и критические чтения рукописи.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Roth | 4227.3 | Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | To determine quality and quantity of RNA extract | |
| Crushed ice maker | Various brands | To keep samples on ice during sample processing | |
| Dewar flask | Various brands | Used as liquid nitrogen container | |
| Ethanol, absolute | Roth | 9065.1 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | Kit components: 2X Hi-RPM Hybridization Buffer 25X Fragmentation Buffer 10X Gene Expression Blocking Agent |
| Gene Expression Wash buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5325 | Kit components: Gene Expression Wash Buffer 1 Gene Expression Wash Buffer 2 Triton X-102 |
| Heat block | Various brands | It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight. |
| Hybridization gasket slide kit | Agilent | G2534-60014 | |
| iQAir air cleaner | To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area | ||
| Isopropanol | Roth | 9866.5 | |
| Lint-free paper, Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | KC34155 | |
| Low Input Quick Amp Labeling Kit | Agilent Technologies | 5190-2305 | Kit components: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Nuclease-free water Cyanine 3-CTP |
| Metal spatula, small | Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples. | ||
| Microarray scanner | Agilent Technologies | Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended | |
| Microfuge tubes, nuclease-free | Various brands | 2.0 mL and 1.5 mL volume | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5810 R | It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes |
| Mini incubator | Labnet | I5110-230V | Any small incubator will do. |
| Mortar and pestle | Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen. | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Nanodrop 1000 | Peqlab / Thermofisher | ||
| Nuclease-free water | Biozym | 351900302 | |
| One-Color RNA Spike-In Kit | Agilent | 5188-5282 | Kit components: One color RNA Spike-Mix Dilution Buffer |
| Ozone barrier slide cover kit | Agilent | G2505-60550 | Optional but highly recommended |
| PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
| Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Pipette tips, nuclease free, filter tips | Various brands | To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
| Pipettor set | Various brands | For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
| RNA Extraction Buffer | 10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 ul/mL β-mercaptoethanol |
We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily | |
| RNase-free DNase set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RW Buffer RPE Nuclease-free water |
| RNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 74904 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) QIAshredder spin column (purple) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RLC Buffer RW1 Buffer RPE Nuclease-free water |
| Slide holders for DNA microarray scanner | Agilent | G2505-60525 | |
| Slide staining dish with removable rack | DWK Life Sciences 900200 | Fisher Scientific 08-812 | We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack) |
| Sodium chloride | Roth | P029.1 | |
| Ultralow temperature freezer | Various brand | Capable of storing sample at -80 °C | |
| Vortex mixer | Various brands | At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes |
Referencias
- Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), (2018).
- Püffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform. Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).
- Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. Catalyzing plant science research with RNA-seq. Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).
- Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. RNA-Seq methods for transcriptome analysis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
- Radchuk, V. V., et al. Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain. Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).
- Sreenivasulu, N. Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination. Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).
- Sreenivasulu, N., Wobus, U. Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots. Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).
- Butardo, V. M., et al. Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis. Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).
- de Guzman, M. K., et al. Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination. Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).
- Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress. Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).
- Anacleto, R., et al. Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
- Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling. BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).
- Druka, A., et al. An atlas of gene expression from seed to seed through barley development. Functional & Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).
- Fujita, M., et al. Rice Expression Atlas In Reproductive Development. Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).
- Wang, L., et al. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice. The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).
- Yamakawa, H., Hakata, M. Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).
- Shakoor, N., et al. A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums. BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).
- Yu, Y. L., et al. Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development. Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).
- Kochevenko, A., et al. Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress. BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).
