Obtenir des données transcriptome de haute qualité à partir de graines de céréales par une méthode modifiée pour le profilage de l’expression génique
Summary
Une méthode de profilage transcriptome des céréales est présentée. Le profilage d’expression génétique à base de microarray commence par l’isolement de l’ARN total de haute qualité des céréales et se poursuit avec la génération d’ADNC. Après l’étiquetage de l’ARN et l’hybridation de microrésarroie, des recommandations sont données pour la détection des signaux et le contrôle de la qualité.
Abstract
La caractérisation de l’expression génique dépend de la qualité de l’ARN. Dans la germination, le développement et la maturité des graines de céréales, l’extraction de l’ARN de haute qualité est souvent entravée par l’amidon élevé et la teneur en sucre. Ces composés peuvent réduire à la fois le rendement et la qualité de l’ARN total extrait. La détérioration de la quantité et de la qualité de l’ARN total peut par la suite avoir un impact significatif sur les analyses transcriptomiques en aval, qui peuvent ne pas refléter avec précision la variation spatiale et/ou temporelle du profil d’expression génique des échantillons testés. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode optimisée pour l’extraction de l’ARN total avec suffisamment de quantité et de qualité pour être utilisé pour l’analyse transcriptionmère entière des grains de céréales. La méthode décrite convient à plusieurs applications en aval utilisées pour le profilage transcriptomique des semences de céréales en développement, en germination et matures. La méthode de profilage transcriptome à l’aide d’une plate-forme de microarray est montrée. Cette méthode est spécifiquement conçue pour le profilage d’expression génique des céréales avec des séquences de génome décrites. La procédure détaillée de la manipulation de microarray au contrôle final de la qualité est décrite. Cela comprend la synthèse de l’ADNC, l’étiquetage de l’ARN, l’hybridation microrésion, la numérisation des diapositives, l’extraction des fonctionnalités et la validation de la qualité des données. Les données générées par cette méthode peuvent être utilisées pour caractériser le transcriptome des céréales pendant la germination, à divers stades de développement du grain, ou à différentes conditions de stress biotique ou abiotique. Les résultats présentés ici illustrent les données de transcriptome de haute qualité qui sont compréhensibles pour les analyses bioinformatiques en aval, telles que la détermination de gènes exprimés différemment (DEG), la caractérisation des réseaux de réglementation des gènes et la réalisation d’une étude d’association à l’échelle du transcriptome (TWAS).
Introduction
Le transcriptome représente l’ensemble complet des transcriptions d’acide ribonucléique (ARN) exprimées par le génome d’un organisme à un moment donné et en particulier les conditions environnementales et de croissance. Chaque cellule a son transcriptome individuel, qui reflète son état physiologique et métabolique actuel. Une collection de cellules dérivées d’un tissu ou d’un organe similaire est utilisée dans une étude typique de transcriptome, mais les transcriptomics à cellule unique et spatialement résolues deviennent populaires1. Les analyses transcriptomiques commencent par l’extraction de l’ARN total à partir d’un tissu sélectionné à un moment précis, et dans des conditions de croissance définies. À cette fin, nous recommandons l’utilisation d’une méthode nouvellement développée pour l’extraction de l’ARN total à partir d’échantillons riches en amidon ou en sucre, tels que les graines de céréales2. La comparaison des transcriptomes entre différents échantillons entraîne l’identification de molécules d’ARN avec une abondance différente. Ces molécules d’ARN sont considérées comme des gènes exprimés différemment (DEG). L’abondance de transcriptions dérivées de gènes marqueurs spécifiques peut alors être utilisée pour estimer l’état du développement ou déterminer la réponse d’un organisme aux fluctuations environnementales. Les gènes qui n’ont aucun changement détectable dans leur abondance de transcription à travers les points de temps de développement à l’étude sont souvent utilisés comme gènes de référence ou d’entretien ménager.
L’ARN est généralement détecté et quantifié par diverses méthodes, telles que le ballonnement du Nord et la réaction quantitative en chaîne de polymérase inverse (qRT-PCR), mais les méthodes actuelles de transcriptomique à haut débit reposent fortement sur l’hybridation de l’acide nucléique à l’aide de la technologie de microrésorité ainsi que du séquençage de l’ARN (ARN-Seq). RNA-Seq est très populaire à l’heure actuelle parce qu’il fournit plusieurs avantages pour les applications transcriptomiques à haut débit comme examiné ailleurs3,4. Bien qu’une technologie plus ancienne, le profilage d’expression génique à l’aide de puces microarray est encore largement utilisé parce qu’il s’agit d’une technologie plus établie, qui nécessite moins d’une formation en bioinformatique. Par rapport à l’ARN-Seq, les ensembles de données générés par les expériences de microrésion sont plus petits et plus faciles à analyser. En outre, il est plus rentable, surtout s’il s’agit de grands nombres d’échantillons. Dans notre laboratoire, nous utilisons régulièrement des analyses transcriptomiques à l’aide de la technologie de microrésion pour déterminer le rôle des centres de réglementation centraux qui régissent les réseaux moléculaires et les voies impliquées dans la croissance, le développement et le métabolisme des céréales5,6,7,8,9. Nous l’utilisons également régulièrement pour mener des études de profilage d’expression génique à l’échelle du génome afin d’obtenir une compréhension mécaniste de la réponse des céréales aux stress abiotiques10, ainsi que dans la conduite de l’association à l’échelle du transcriptome (TWAS) et des études de cartographie de liaison pour identifier les gènes responsables de la qualité des céréales et de la nutrition11,12. D’autres groupes ont également utilisé la technologie de micro-array pour fournir l’atlas d’expression génique spécifique au développement dans l’orge13, le riz14,15,16, le sorgho17, et le blé18.
Le but de cette publication est de fournir un bref résumé textuel et une description visuelle détaillée de la méthode que nous employons actuellement dans notre laboratoire pour le profilage transcriptomique des céréales à l’aide d’une plate-forme de microrésion agile. Veuillez noter que d’autres plates-formes de microrésarroie sont disponibles, mais ne seront pas couvertes par cette méthode. Nous commençons le protocole en présentant une description détaillée de l’extraction de l’ARN à partir de la mise au point ou de la germination des graines de céréales. D’après notre expérience, l’obtention d’un transcriptome de haute qualité et de haute quantité prêt à des analyses transcriptomiques en aval est souvent le goulot d’étranglement lors de l’utilisation des tissus de graine. Nous avons essayé plusieurs kits d’extraction d’ARN disponibles dans le commerce, mais aucun n’a fourni des résultats satisfaisants. Par conséquent, nous avons développé un protocole d’extraction chimique pour obtenir un extrait d’ARN brut qui est ensuite soumis à la purification de colonne utilisant un kit disponible dans le commerce. En utilisant cette méthode, nous obtenons régulièrement et de façon reproductible ARN2 (figure 1), qui peut être utilisé pour différentes applications en aval pour générer un profil transcriptome.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite fournit des résultats hautement reproductibles pour les extraits d’ARN à haut rendement et de haute qualité(figure 1). Sur la base de notre expérience, nous recommandons trois répliques biologiques pour un génotype, stade ou condition pour l’analyse. Pour être en mesure de détecter des différences statistiquement significatives, l’abondance générale de l’ARNm doit être considérée. Veuillez noter, cependant, qu’une quantité de départ d’échantillons de tissu de 200 mg est nécessaire dans les triplicates pour l’étape d’extraction d’ARN. Par conséquent, pour les expériences qui ont une quantité limitée d’échantillons tels que les matières végétales génétiquement modifiées, cette méthode peut ne pas être appropriée.
Pendant l’hybridation de microrésarroie, les étapes suivantes sont les plus critiques : (1) chargement des échantillons sur la glissière du joint (étape 4.7) et (2) lavant les tableaux après l’hybridation (étapes 4.13 et 4.14). La charge de l’échantillon doit être faite très soigneusement pour éviter la formation de bulles et le déversement de liquide. La prudence est de mise lorsque l’on met la glissière de microrésarroie sur la glissière du joint contenant les échantillons chargés : le côté ADN (avec des sondes tachetées) doit faire face vers le bas pour permettre l’hybridation. Pour laver les microrésabres, la deuxième étape de lavage est particulièrement critique : ici, enlever les diapositives du tampon de lavage 2 doit être effectuée très lentement (10 s) pour éviter les artefacts tampons sur les diapositives, ce qui peut interférer avec l’acquisition et les analyses de données.
Afin de recevoir les résultats de l’expérience d’hybridation qui sont admissibles à l’analyse de bioinformatique en aval, il faut suivre quelques critères importants. Le rapport de QC, qui est produit après le rendement du protocole ci-dessus, donne une bonne idée de ce qui devrait être amélioré, et quelles données sont dans un état utilisable(figure 3). La première information reçue est la grille visualisée(figure 2). Ici, on peut voir directement si toutes les zones pour la fluorescence lu-out sont correctement alignés. S’il y a un décalage visuellement détectable, cela influencera toutes les autres valeurs (contexte, intensité du signal, etc.) et la lecture de cette puce ne peut pas être utilisée. Sur la vue d’ensemble (Distribution spatiale de toutes les valeurs aberrantes), on peut facilement repérer toute contamination (p. ex., poussière ou cheveu), qui a affecté le résultat. La saleté peut être enlevée en soufflant doucement et en rescannant la puce. L’histogramme de la parcelle de signalisation mentionné ci-dessus devrait entraîner une large courbe en forme de Gauss, avec seulement des valeurs aberrantes mineures(figure 2). Selon le tissu analysé(figure 1), cette courbe peut sembler différente et peut sembler avoir deux pics, ou un pic prédominant avec une épaule. Cela n’influencera pas la qualité des données. Seul un pic décalé fort, ou des signaux élevés sur les bords indiquent des problèmes, tels que les «monstres verts» (intensités de fluorescence trop élevées), qui ne peuvent pas être enlevés par lavage et doivent être signalés au fabricant de puces. En outre, le « graphique de distribution spatiale pour les signaux médians » devrait varier autour d’une valeur commune. Cela devrait être dans la gamme entre 40 et 100, selon la lecture d’intensité générale de la puce analysée. Un autre contrôle de la qualité important est l’évaluation de la pointe des données : le graphique de bord pour le pic des signaux devrait entraîner une ligne linéaire et régulière. Enfin, le tableau des « mesures d’évaluation » donne une bonne vue et fiable des résultats reçus. Ici, le fabricant fournit une gamme de valeurs qui peuvent être classées comme Excellent, Bon et Évaluer (Figure 3). Selon notre expérience, certaines valeurs ne peuvent pas toujours être appliquées pour toutes les puces. Pour les croustilles personnalisées de riz, la « valeur non-contrôle » était souvent hors de portée, mais n’affecte pas considérablement davantage le traitement des données. En outre, la gamme de “NegControl” pourrait être étendue, basée sur les tissus, l’organisme et la sortie générale de la puce à ‘lt;80. La gamme d’évaluation de la valeur E1 med CV pourrait être étendue à ‘lt;9, au lieu de ‘lt;8 selon notre expérience. Par la suite, une évaluation appropriée de toutes les données lues de puces est possible. En général, il faut toujours garder à l’esprit que les répliques biologiques indépendantes donnent toujours le résultat le plus fiable.
L’avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes réside dans le fait qu’elle représente une méthode rentable et à haut débit pour le profilage transcriptionnel. De plus, le pipeline d’analyse de données en aval est plus facile et plus établi. Malgré les avantages, il existe certaines limites de cette technique, comme le nombre de gènes qui peuvent être analysés. La microrésarroie ne peut que faciliter l’analyse des gènes précédemment repérés sondes sur le tableau. Par conséquent, cette technique ne s’applique qu’aux espèces végétales avec des génomes séquencés et des gènes entièrement annotés. Nous prévoyons que la transcriptomique basée sur le microarray continuera d’être très utile et pertinente non seulement pour le profilage de l’expression génique, mais aussi pour d’autres pipelines de bioinformatique en aval tels que les analyses de réseaux de réglementation des gènes et l’étude d’association à l’échelle du transcriptome.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus dans le cadre de la zone thématique DU CGIAR Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III, et IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Allemagne. Nous remercions Mandy P’ffeld pour son excellente assistance technique et la Dre Isabel Maria Mora-Ramirez pour le partage d’informations et d’expérience avec la puce de blé. Nous remercions le Dr Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Allemagne) pour les commentaires et la lecture critique du manuscrit.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Roth | 4227.3 | Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | To determine quality and quantity of RNA extract | |
| Crushed ice maker | Various brands | To keep samples on ice during sample processing | |
| Dewar flask | Various brands | Used as liquid nitrogen container | |
| Ethanol, absolute | Roth | 9065.1 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | Kit components: 2X Hi-RPM Hybridization Buffer 25X Fragmentation Buffer 10X Gene Expression Blocking Agent |
| Gene Expression Wash buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5325 | Kit components: Gene Expression Wash Buffer 1 Gene Expression Wash Buffer 2 Triton X-102 |
| Heat block | Various brands | It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight. |
| Hybridization gasket slide kit | Agilent | G2534-60014 | |
| iQAir air cleaner | To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area | ||
| Isopropanol | Roth | 9866.5 | |
| Lint-free paper, Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | KC34155 | |
| Low Input Quick Amp Labeling Kit | Agilent Technologies | 5190-2305 | Kit components: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Nuclease-free water Cyanine 3-CTP |
| Metal spatula, small | Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples. | ||
| Microarray scanner | Agilent Technologies | Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended | |
| Microfuge tubes, nuclease-free | Various brands | 2.0 mL and 1.5 mL volume | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5810 R | It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes |
| Mini incubator | Labnet | I5110-230V | Any small incubator will do. |
| Mortar and pestle | Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen. | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Nanodrop 1000 | Peqlab / Thermofisher | ||
| Nuclease-free water | Biozym | 351900302 | |
| One-Color RNA Spike-In Kit | Agilent | 5188-5282 | Kit components: One color RNA Spike-Mix Dilution Buffer |
| Ozone barrier slide cover kit | Agilent | G2505-60550 | Optional but highly recommended |
| PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
| Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Pipette tips, nuclease free, filter tips | Various brands | To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
| Pipettor set | Various brands | For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
| RNA Extraction Buffer | 10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 ul/mL β-mercaptoethanol |
We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily | |
| RNase-free DNase set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RW Buffer RPE Nuclease-free water |
| RNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 74904 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) QIAshredder spin column (purple) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RLC Buffer RW1 Buffer RPE Nuclease-free water |
| Slide holders for DNA microarray scanner | Agilent | G2505-60525 | |
| Slide staining dish with removable rack | DWK Life Sciences 900200 | Fisher Scientific 08-812 | We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack) |
| Sodium chloride | Roth | P029.1 | |
| Ultralow temperature freezer | Various brand | Capable of storing sample at -80 °C | |
| Vortex mixer | Various brands | At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes |
Referencias
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