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Biología

예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

Published: March 31, 2020
doi:
10.3791/60596
, , , ,
1Department of Pathology,University of Washington

Summary

이 기사에서는 예쁜꼬마선충을 세포외 소포를 생성, 정화 및 정량화하는 방법을 제시합니다.

Abstract

외부 환경에 작은 막 바인딩된 소포의 분 비는 모든 세포의 기본적인 생리 적 과정. 이 세포외 소포 (EV) 단백질, 핵산, 대사 산물 및 조직 사이 지질을 전송해서 글로벌 생리적인 프로세스를 통제하기 위하여 세포 외부 기능. EV는 기원세포의 생리학적 상태를 반영합니다. 전기 자동차는 인간의 건강의 거의 모든 측면에서 근본적인 역할을 하는 것이 연루되어 있습니다. 따라서, EV 단백질 및 유전 화물은 건강과 질병의 바이오마커에 대해 점점 더 분석되고 있다. 그러나, EV 필드는 여전히 EV화물 조성의 연구를 허용하는 견인 무척추 동물 모델 시스템이 부족합니다. C. 예쁜꼬마선충은 EV 연구에 매우 적합하며, 이는 EV가 신체 외부의 EV를 외부 환경으로 능동적으로 분비하여 허구의 고립을 허용하기 때문입니다. 이 문서에서는 연령 동기화 된 웜의 매우 큰 인구와 정량적으로 작동하는 방법, 전기 를 정화, 정제 샘플에서 그대로 전기 의 수를 직접 측정하는 유동 세포 분석 프로토콜을 포함하여 이러한 환경 분비 C. elegans EV를 생성, 정화 및 정량화하는 데 필요한 모든 정보를 제공합니다. 따라서, C. 예쁜꼬마선충 연구에 사용할 수 있는 유전자 시약의 큰 라이브러리는 EV 화물 조성에 대한 유전 적 경로 및 생리적 과정의 영향을 조사하기 위해 도청 될 수있다.

Introduction

막 결합된 세포외 소포(EV)의 분비는 세포1사이에서 특정 단백질, 핵산, 대사산물 및 지질 화물을 능동적으로 수송하여 글로벌 생리적 과정을 용이하게 한다. 세포는 2 μm 이상에서 20 nm2만큼작은 크기의 연속체에 걸쳐 있는 EV를 분비합니다. 작은 전기자동차(<200 nm)는 대사장애, 암, 심혈관질환 및 신경퇴행성질환을 포함하는 병리학적 과정에 미치는 영향 때문에 점점 더 연구되고 있다3,,4,,5. 이 병리학은 또한 작은 EV의 EV 화물의 단백질 그리고 유전 조성에 영향을 미치기 위하여 보였습니다. 따라서, 병리학의 바이오마커 시그니처는 LC-MS-MS 및 RNAseq6,7,7,8,,9와같은 EV 화물 발견 방법을 통해 점점 더 밝혀지고 있다.

C. 예쁜꼬마선충은 진화적으로 보존된 EV 신호 경로를 식별하는 데 유용한 무척추 동물 모델이었습니다. 예를 들어, C. elegans flippase는 C. elegans 배아에서 EV 생물 발생을 유도하기 위해 처음 나타났으며, 인간 상동성은 인간 세포10,,11에서EV 방출에 영향을 미치는 것으로 나타났다. C. 예쁜꼬마선충EV는 표피 발달에 필요한 고슴도치 신호를 전달하는 것으로 보고되었다. 고슴도치 및 기타 모르포겐의 전달은 전기자동차의 주요 발달 역할을 하는 것으로 나타났으며, 제브라피시, 마우스 및 인간12,,13,,14,,15에서보존된다. C. 예쁜꼬마선충은 동물대,17 동물통신에서기능하는 생체 밖에서 전기자동차를 분비하기 때문에 EV 바이오마커 발견에 적합합니다(그림1A). 그러나, 이전 연구를 통해 확립된 방법론은 선충의 대장균 식품 공급원도 전기자동차18을분비하기 때문에 사용할 수 없다. 이 방법에서, 대부분의 시료는 대장균 오염으로 구성되며, C. elegans EV 화물의 발견을 위한 프로테오믹 또는 RNAeq 접근법의 힘을 제한한다. 여기에 기술된 방법은 전형적인 세포 배양 실험의 특징적인 풍부수준에서 고도로 순수한 C. elegans EV를 산출하고 따라서 EV biomarker 발견을 위한 오믹 접근을 촉진하기 위하여 개발되었습니다.

화물 분석을 위해 충분한 수의 전기 를 생성하려면 많은 수의 웜이 필요합니다. 따라서, 발달 동기화 된 C. 예쁜 꼬마의 많은 인구의 정량적 재배를 수행하는 방법도 포함되어 있습니다. 일반적으로 실험에 많은 수의 웜이 필요한 경우 액체 매체에서 배양됩니다. 이것은 벌레의 큰 인구를 생성하기 위해 효과적이지만, 동물의 생리학은 선충 성장 매체 (NGM) 한천 접시에 표준 조건하에서 재배 된 벌레와 상당히 다릅니다. 액체에서 배양된 동물은 더 느리게 성장하고, 얇고, 발달이성이며, 높은 수준의 배치 가변성을 받는다. 따라서, 우리는 10cm 높은 성장 판을 사용하여 발달 동기화 C. 예쁜 꼬마의 큰 인구의 정량적 재배를위한 간단하지만 효과적인 수단을 제시한다. 고성장 플레이트의 미디어 조성은 일반 NGM 플레이트보다 더 많은 펩톤을 포함하고 OP50보다 더 강력하게 성장하는 대장균 균주 NA22로 시드됩니다.

유세포분석 기술(FACS)의 발전으로 개별 EV20,,21을직접 분석할 수 있게 되었으며, 다른 방법에 내재된 제한 없이 전기자동차의 정량화를 가능하게 되었습니다. 이전 연구는 상이한 정제 방법론이 EV 대 단백질비율(22)을현저하게 상이하게 초래하기 때문에 단백질이 EV 풍부에 대한 유용한 프록시가 아니라는 것을 보여주었다. 매우 순수한 EV 분획은 상대적으로 적은 단백질을 함유하고 있어 BCA 또는 쿠마시 젤로 시료를 정량화하기가 어렵습니다. 서양 분석은 개별 단백질의 상대적인 다름을 확인할 수 있습니다 그러나 견본에 있는 얼마나 많은 전기를 확인할 수 없습니다. 나노 입자 추적 분석에 의한 EV 수의 강력한 정량화는 좁은 신호 대 잡음 범위, 전기 자동차와 고체 응집체를 구별할 수 없음, 서로 다른 사양23을가진 계측기 간의 방법 전달 성 부족으로 인해 방해를 받고 있습니다. 따라서 이 문서에는 전기 자동차의 판별 및 정량화를 위한 일반화 가능한 유동 세포 측정 절차도 포함되어 있습니다.

Protocol

1. 준비 젤라틴 2 g을 dH2O 100 mL에 넣고 끓이기 시작할 때까지 전자레인지에서 가열합니다. 그런 다음 저어서 20 분 동안 식힙니다. 용액을 0.22 μm 필터를 통과하여 멸균 튜브에 분주합니다. 파이펫 팁을 사용 직전에 파이펫팅하고 젤라틴 용액을 배출하여 처리하십시오. 처리된 팁은 즉시 사용하거나 저장할 수 있습니다. 멸균 캡 필터에서 멤브레인을 잘라냅니다. 5 μm 나일론 메쉬 직물의 20cm 사각형을 적시고 멸균 캡 필터의 상단 주위에 놓습니다. 여러 개의 두꺼운 고무 밴드로 고정하십시오.주의: 주름이 없는지 확인하기 위해 직물을 주의 깊게 검사하십시오. 이는 흡입을 방해하는 공기 간격을 만듭니다. 2. 웜의 큰 인구 계산(그림 1A) 웜 경작판 뚜껑 또는 유리 슬라이드 상에 웜 현탁액의 소용돌이 및 피펫 10 μL. 이 과정을 3x 반복합니다. 각 방울에 있는 동물의 수를 기록합니다. 웜 현탁액을 μL당 2마리의 동물로 조정합니다. 서스펜타와 피펫을 슬라이드 또는 플레이트 뚜껑상에 9방울(10 μL)으로 소용돌이. 동물의 수를 수동으로 계산합니다. 각 방울에 있는 동물의 수를 기록합니다. 각 웜 모집단의 백분율로 평균(S.E.M.)의 평균 및 표준 오차를 계산합니다. 평균 값을 10 μL로 나눈 다음 μL에서 웜 현탁액의 총 부피를 곱하여 각 집단의 총 동물 수를 계산합니다. 그림 1: C. elegans EV를 생성, 정량화 및 정화하기 위한 절차 개요입니다. (A)동물의 큰 인구를 계산하기위한 회로도. (B)전기 자동차 를 수확하기위한 웜을 생성하기위한 회로도. (C) C. 예쁜꼬마선충에서 전기자동차를 정화하기 위한 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3. EV 정화를 위한 C. 예쁜꼬마선충 재배 개발 동기화 C. 예쁜 꼬마의큰 인구를 생성합니다. 이렇게 하려면 아래 단계를 따르십시오. 6cm 정상 성장 매체 플레이트에 단일 동물을 추가합니다. 2 세대 동안 배양 한 다음 두 개의 고성장 배지 플레이트에 동물을 씻는다. 벌레가 음식을 다 써버린 때까지 배양합니다. 1.4단계에서 제조된 5 μm 나일론 메쉬로 L1 웜을 필터링합니다. 스크류 캡을 멸균 병에 놓고 진공을 시작하고 필터 위에 벌레를 붓습니다. 필터의 웜 집계를 통해 매질의 동일한 볼륨을 전달합니다. 웜을 정량화하고 총 수를 계산합니다(2단계 참조). 최근 굶주린 (&24 시간) 고성장 판에서 자란 벌레는 약 80,000 L1 애벌레를 초래합니다. 원심분리기 L1 유충은 2,000 x g에서 3 분 동안. mL 당 ~ 100,000 마리의 동물로 재중단. 고성장 판당 ~ 50,000마리의 동물을 배치합니다. 동물을 20°C에서 그레이비드 어른(약 72시간)까지 경작합니다. 표준 수단으로 gravid 성인을 표백하고 배아가 2.5 μg / mL 콜레스테롤로 S 기초 용액의 10 mL에서 부화 할 수 있습니다. L1 애벌레를 정량화한 다음(2단계 참조) 각 고성장 판에 50,000개의 웜을 추가합니다. 동물이 젊은 성인이 될 때까지 20 °C에서 접시를 재배하십시오. 분비 세대를 위해 C. 예쁜꼬마선충을 준비하십시오. 각 고성장 플레이트에 50 μg/mL 카베니실린으로 멸균 M9 15mL를 추가하여 플레이트에서 웜을 세척합니다. 포화 판이 5 분 동안 앉아있게하십시오. 슬로싱을 피하십시오. 각 플레이트의 버퍼를 별도의 50 mL 원엽 튜브에 붓습니다. 플레이트당 총 45mL의 버퍼에 대해 세척 단계를 2배 더 반복합니다. 벌레가 15 분 동안 정착하게하십시오. 총 4x에 대해 반복합니다. 30% 자당 단계 그라데이션의 상단에 벌레를 띄우고 S 기초 용액(24)에서동물을 복구한다. 얼음 차가운 100 mM NaCl의 15 mL에서 벌레를 잠시 다시 중단하고 얼음 차가운 60 % 자당 15 mL를 추가하고 혼합합니다. 유리 피펫으로 자당 혼합물 의 상단에 얼음 차가운 100mMNaCl의 5 mL을 부드럽게 층. 1,500 x g의 원심분리기는 5분 동안. 웜은 NaCl과 자당 사이의 계면에 집중될 것이다. 인터페이스에서 동물을 부드럽게 피펫하여 새로운 50 mL 원엽 튜브로 바릅니다. 50 mL에 S 기저 용액을 추가하십시오. 벌레가 5분 동안 정착할 수 있도록 허용합니다. 상급을 장식하고 S 기저용의 신선한 50 mL를 추가하십시오. 이 작업을 3배 이상 반복합니다. 2단계에서 설명한 대로 웜 수를 정량화합니다. 콜레스테롤 2.5 μg/mL, 카베니실린 50 μM을 함유한 멸균 S 기저용으로 1μL당 한 마리의 동물밀도로 웜을 다시 정지시하십시오. 분비 생성을 위해 샘플을 제조하려면 멸균 2L 바닥 배플 플라스크에 최대 400 mL의 현탁액을 추가합니다. 24 시간 동안 100 rpm에서 20 °C 인큐베이터에 원형 회전자 위에 플라스크를 놓습니다. 4. EV 정화 수확 및 분획 인큐베이터에서 2L 의 벌레 플라스크를 제거하고 50 mL 원추형 바이알 (2 분 동안 500 x g)에서 동물을 펠렛합니다. 0.22 μm 진공 필터를 통해 상급물을 부어 미립자 이물질을 제거합니다.참고: 이 시점에서, 소포및 소포를 포함하는 여과된 상상급은 -80°C에서 저장될 수 있다. 2단계에서 설명한 대로 동물의 수를 계산합니다. 세균성 잔디에 일시 중단 된 벌레의 방울을 배치 하 여 벌레의 생존을 결정 합니다. 15 분 동안 기다린 다음 이동, 마비, 또는 죽은 동물로 점수. 재생된 니트로셀룰로오스 10 kDa 필터 유닛을 사용하여 0.22 μm 여과 된 상판을 700 μL로 농축하십시오. 150 μL S 기저 용액을 추가한 다음 필터와 소용돌이 위에 파이펫을 추가합니다. 2x를 반복합니다. 농축 된 상급체를 4 °C에서 20 분 동안 18,000 x g에서 원심 분리하고 상판을 새로운 튜브로 옮긴다. 이 단계는 처리 중에 누적되었을 수 있는 잠재적인 파편이나 더 큰 입자를 제거합니다. 프로테아제 억제제 칵테일 + EDTA를 제조업체의 지침에 따라 추가합니다.참고: 이 시점에서 분비체 및 소포를 함유하는 농축 상층체는 -80°C에서 보관될 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 80-200 μm 아가로즈 수지 (구형 단백질의 경우 70,000 ~ 40,000,000 kDa의 공극 크기 분획 범위)를 빈 중력 흐름 컬럼 카트리지에 붓습니다. 수지 침대가 10 mL의 최종 부피로 포장 될 때까지 흐름 S 기저 용액.참고 : 너무 많은 수지가 열 카트리지에 부어 경우, 다음 열의 상단을 분산하고 파이펫과 여분의를 제거합니다. 기둥을 통해 멸균 여과 S 기저용 용액 40 mL을 통과하고 중력하에서 흐르게하십시오.주의: 수지가 방해받지 않는지 확인합니다. 수지의 상단이 물에 잠기지 않을 때까지 버퍼 흐름을 한 다음 열 카트리지의 맨 아래에 캡을 두십시오. 기둥 아래에 수집 튜브를 배치합니다. 카트리지에 놓인 캡을 제거합니다. 2.1단계에서 얻어진 농축 분비액을 컬럼 베드의 상부에 드롭와이즈로 첨가한다. S 기저용 용액의 파이펫 1 mL 드롭 와이즈. 기둥 아래에 신선한 수집 튜브를 놓습니다. 수지를 방해하지 않도록 5 mL S 기저용으로 상부 컬럼 저장소를 천천히 채웁니다. 용출액의 처음 2 mL을 수집 한 다음 신속하게 튜브를 변경하고 다음 4 mL을 수집합니다. 이것은 전기 자동차용으로 보강되는 분수입니다. 재생된 니트로셀룰로오스 10 kDa 분자량 차단(MWCO) 필터와 저결합 미세원심지 튜브로 의 전달 리텐테이트를 사용하여 300 μL로 용출액을 농축한다. 20s에 대한 소용돌이 및 필터를 가로 질러 버퍼를 피펫팅하여 S 기저 용액의 100 μL로 필터 멤브레인 2x를 세척하십시오. 500 μL의 최종 부피에 대한 초기 샘플에 추가합니다. 제조업체의 지침에 따라 프로테아제 억제제 칵테일을 추가합니다. 다운스트림 실험을 즉시 수행(RNAeq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, 서양, FACS 등) 또는 -80°C에서 저장한다. 5. 유동 세포 측정체 정량화 EV 풍부 염료 준비 신선한 DMSO를 사용하여 DI-8-ANEPPS의 10mMM 스톡을 준비합니다. 10 μL aliquots에 분배하고 -20 °C에 저장하십시오. 염료 스톡 10 μL의 튜브에 90 μL의 멸균 여과 된 PBS를 추가하여 1 mM 작업 용액을 준비하십시오. 실험 샘플 준비 840 μL의 S 기저용액을 미세원원지 튜브에 넣습니다. 그런 다음 섹션 4.2 및 소용돌이에서 생성된 정제된 전기 전기의 60 μL을 추가합니다. 2개의 새로운 마이크로원심지 튜브로 시료의 300 μL을 Aliquot. 이제 각각 300 μL의 희석 된 전기 를 포함하는 3 개의 튜브의 실험 세트가 있습니다. 튜브#1-3에 라벨을 붙입니다. #2 시료 #3에 5.1.2로 제조된 DI-8-ANEPPS 스톡의 7 μL을 추가합니다. 그런 다음 튜브 #3 1% 트리톤-X 100의 7 μL을 추가합니다. 각 튜브를 소용돌이로 섞습니다. 초음파 처리기 샘플은 시료 중간에 초음파 처리기 팁을 배치하고 20% 전력 30% 듀티 사이클에서 10회 펄스하여 #3.주의: 음파 처리기 프로브의 끝이 시료 중간에 있는지 확인하여 폼 생성이 최소화되도록 하십시오. 폼은 EV가 집계되는 원인이 되어 샘플을 손상시킬 수 있습니다. 두 개의 미세 원심 분리튜브에 300 μL의 S 기저용을 추가합니다. 5.1단계에서 제조된 DI-8-ANNEPS 작업 시약의 7 μL을 제2 튜브 및 라벨 “염료 전용”에 첨가한다. 다른 튜브를 “버퍼 전용”으로 레이블을 지정합니다.참고: 염료 전용 및 버퍼 전용 제어 샘플과 동일한 S 기저 소스로 실험 샘플을 준비합니다. 샘플을 직접 광에서 1 시간 동안 실온에서 배양합니다. FACS 실험을 수행합니다. FACS 여기 필터를 488 nm(파란색)로 설정하고 방출 필터를 605 nm(주황색)로 설정합니다. 유량을 분당 1.5μL로 설정합니다. 나노비드 FACS 캘리브레이션 믹스를 실행합니다(선택 사항이지만 권장). FACS 컴퓨터에서 각 샘플을 3분(180초) 동안 실행합니다. 정확한 실행 시간을 몇 초 단위로 기록합니다. FACS 데이터를 분석합니다. FACS 분석 소프트웨어로 파일을 엽니다. 드롭다운 메뉴에서 선택하여 축을클릭하여 Y축을 488-조직(영역)으로 전환합니다. SALS 레벨 102에서 10 4(<300 nm4 크기의 파티클)에 걸쳐 플롯의 맨 위에서 시작되는 직사각형 게이트를 설정합니다. 전체 이벤트의 2.5%가 포함될 때까지 게이트를 아래쪽으로 확장합니다. 게이트이름을 “DI-8-ANEPPS+” 이벤트로 지정합니다. 샘플 EV 풍부도정량화 이 게이트를 복사하여 실험 세트의 다른 두 샘플과 버퍼 전용 및 염료 전용 컨트롤에 붙여 넣습니다. 분석을 스프레드시트로 내보냅니다. FACS 샘플이 권장 되는 3 분 (180 s)에 대 한 실행 되지 않은 경우 180 s 당 이벤트에 샘플에서 모든 이벤트 수를 정규화 합니다. 예를 들어 샘플이 250s에 대해 실행된 경우 DI-8-ANEPPS+ 이벤트 번호는 250s/180s로 조정됩니다. 염료 전용 컨트롤에서 샘플 #2 DI-8-ANEPPS+ 이벤트 수를 빼서 염료 배경 이벤트를 제거합니다. 샘플 #1 DI-8-ANEPPS+ 이벤트 수를 빼서 이색 배경 이벤트를 제거합니다. 샘플 #3 DI-8-ANEPPS+ 이벤트 수를 빼서 세제에 민감하지 않은 이벤트를 제거합니다. 이 값은 선의의 EV의 수입니다. 5.5.5단계에서 계산된 값을 μL(5.3단계에서 설명한 대로 분석된 4.5 μL)으로 나누고 희석 계수(2.5단계에서 설명한 대로 10배)를 곱하여 시료의 1 μL의 EV 수를 계산합니다. 이 값에 EV 준비에 남은 μL 수를 곱합니다. 다운스트림 분석에 사용할 수 있는 전기 자동차 수입니다. 그림 2: EV 풍부도를 정량화하기 위한 유세포 분석 샘플 준비의 회로도. (A)EV 제제는 3개의 동일한 샘플로 나뉜다. 샘플 # 1은 염료 음성 대조군입니다. DI-8-ANEPPS는 #2 및 #3 샘플에 첨가됩니다. 트리톤-X 100은 샘플 #3 첨가됩니다. 녹색 화살표는 샘플 #3 이후에 초음파 처리된다는 것을 나타냅니다. 흐름의 데이터는 FACS 샘플에서 세제에 민감한 전기 의 절대 수를 결정한 다음 전체 준비에서 충분한 전기 를 계산하는 데 도움이됩니다. 염료 양성 이벤트를 결정하기 위한 게이트는 염료가 없는 샘플 #1 설정되어 있습니다. 스프레드시트 데이터에 적색 쓰기는 세제 처리 된 샘플의 염료 양성 이벤트가 염료로 샘플에서 차감된다는 것을 설명하기 위한 것입니다. (B)FACS에서 EV를 정량화하고 샘플의 총 EV 수를 계산하는 방정식입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Representative Results

EV를 생성하고 정화하는 데 필요한 프로세스에 대한 회로도는 그림 1에나와 있습니다. 각 단계를 완료하는 데 필요한 일반적인 시간은 아래에 표시됩니다. 도 2는 DI-8-ANEPPS(그림2A)를사용하여 FACS 분석을 위한 샘플을 준비하기 위한 회로도뿐만 아니라 샘플에서 총 EV 수를 추정하는 데 필요한 계산을 나타낸다(그림2B). 도 3A에10개의 생물학적 복제의 대표적인 결과가 도시되어 있다. 복제물 간의 가변성은 유의하지 않으며 인구 크기의 일반적인 S.E.M.은 10%를 약간 넘습니다(그림3B). 벌레를 걸링하고 신선한 고성장 판에서 재배하면 표백제 동기화에 적합한 중력 성인의 많은 인구를 생성할 것이다. 이러한 방식으로 처리된 단일 굶주린 판은 각 중력 성인이 약 10개의 알을 포함하기 때문에 1 x 106 이상의 동기화된 자손의 실험 집단을 생성할 수 있다. 40 μm 필터를 통해 계란과 애벌레를 걸러서 발달 동기화 된 인구의 큰 인구를 유지하여 오래된 동물로부터 전기 를 얻을 수 있습니다. 유지 된 성인은 접시 당 20,000 동물의 밀도로 신선한 고성장 판으로 옮겨질 수 있습니다. 이 과정은 2일마다 반복되었다. 그림 3C는 3개의 플레이트 전달을 통해 이동되는 웜 집단의 3개의 생물학적 복제를 나타낸다. 플레이트 사이에 동물을 옮기면 동물의 약 10% 손실이 발생합니다(도3C)는동물의 약 20%가 자당 부양 단계에서 손실되는 반면(도3D). 그림 3: EV 분석을 위한 C. 예쁜꼬마선충의 대규모 집단의 정량화. (A)최근 굶주인 단일(&24h) 고성장 플레이트로부터 분리된 L1 애벌레 단계 웜의 수를 비교한 것이다. 10개의 생물학적 복제물의 각각의 값이 플롯됩니다. 10개의 복제에 있는 모든 데이터 포인트의 합계는 S.E.M이 있는 바이올린 플롯 및 막대로도 제공됩니다. 이것은 최근에 굶주리고 있는 벌레의 단 하나 판이 ~ 80,000 L1 애벌레 단계 벌레를 산출할 것이라는 것을 보여줍니다. (B)패널 A에서 15개의 상이한 플레이트 모성 측정의 S.E.M.은 개별 포인트로 플롯된다. 일반적으로 S.E.M.은 10%보다 약간 큽요. (C)웜 집단의 3개의 생물학적 복제본은 4시간마다 플레이트 간에 각각 2개의 전이 후에 추정되었다. 플레이트 사이에 동물을 옮기는 것은 인구 크기의 현저한 감소를 초래하지 않았다. 이것은 이동 벌레에 대해 여기에 제시 된 방법론이 동물의 상당한 손실을 초래하지 않는다는 것을 나타냅니다. (D)3개의 EV 실험 복제과정을 따라 취한 인구 측정: 실험을 시작한 원래 L1 애벌레에 대해 추정된 동물의 수, 자당 에서 회수된 젊은 성인 동물의 수와 24시간 잠복기에 대비한, 분비물의 회수 시 EV 준비로부터 계산된 동물의 수. L1 애벌레 단계에서 초기 인구 추정 사이 그리고 나중에 동물이 젊은 성인 때 인구 크기의 작지만 유의한 감소가 있습니다. 평균 L1 인구 측정은 100%로 지정되었으며 다른 모든 측정값은 이 값과의 관계에 따라 배율을 조정했습니다. 오류 막대 S.E.M. * = p 값 < 0.05, N.S. = 파라메트릭 페어링 t 검정에서 유의하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 단백질 대 동물 비율은 EV 제제를 특성화하는 데 유용한 메트릭입니다. 이 메트릭은 EV 준비 간의 일관성을 결정하는 빠른 수단을 제공할 수 있습니다. 평균적으로, 1,000마리의 야생형 젊은 성인 동물은 10 kDa보다 큰 단백질 1 μg를 그들의 환경으로 분비합니다(그림4A). 이 분획이 크기 배제 크로마토그래피에 의해 더 분리될 때, 총 단백질 용출 프로파일은 2-6 mL 및 8 mL 후의 큰 피크 사이의 작은 단백질 피크를 나타낸다. EV는 컬럼 용출액의 처음 5 mL에 포함되어있다(도 4B). 나노입자 추적 분석 컬럼 용출의 제1 5 mL은 작은~ 150 nm EV의 단분산 모집단을 함유한다(도4C).Figure 4 크기 배제 분획의 전송 전자 현미경 은 용출물의 2-6 mL 분획에 있는 풍부한 EV를 드러내지 만 나중에 용출물 부피에서는 아닙니다. EV는 컵 모양으로 알려져 있으므로 음의 염색 조건 하에서 제조 할 때 반점 밝은 점으로 나타나는 고체 입자를 구별하기가 쉽습니다(그림 4D). 그림 4: 총 분비 바이오매스로부터 C. 예쁜꼬마선충 의 정제. (a)10kDa보다 큰 총 단백질의 비율을 10개의 생물학적 복제에 대한 제조에서 배양된 웜의 수에 플롯하였다. 대부분의 제제에는 1,000마리의 동물당 1 μg의 단백질이 함유되어 있습니다. (B)농축 분비물의 1 mL로 적재된 10 mL 수지 컬럼으로부터의 단백질 용출 프로파일. 추가 해석에서 통합된 분수는 그룹으로 그늘진다. (C)통합 수지 용출 분획2-6 mL의 나노입자 추적 분석. 95% 신뢰 구간은 회색으로 표시됩니다. (D)통합 수지 용출 분획의 TEM 분석. 시작 물질은 소포 와 같은 입자와 비 소포 입자를 모두 가졌다. 통합된 2-6 mL 용출 분획은 비소포 입자가 적은 소포에 대해 농축되었다. 7-11 mL 통합 분획은 소수의 소포와 같은 입자를 포함하지만 많은 비 소포 입자를 포함했다. 12-15 mL 용출 분획은 비 소포 입자만을 포함하였다. 모든 현미경은 동일한 배율로 표시됩니다. 배율 막대 = 200 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. C. elegans와 인간 EV 사이 유동 세포 측정 특성을 직접 비교하기 위하여는, 우리는 이 방법으로 인간 적인 신경의 세포 배양의 조건부 매체에서 전기를 정화했습니다. 유세포측정은 광 산란을 기반으로 입자를 분리합니다. 작은 각도 광 산란 (SALS)은 크기와 대략 상관 관계가 있으며, 장각 광 산란 (LALS)은 내부 멤브레인 구조와 상관 관계가 있습니다. 세포 배양 및 C. elegans EV 제제 둘 다에서 총 견본 사건의 대다수는 단단히 103 SALS 및 104 LALS를 중심으로 한 클러스터에 집중됩니다(그림 5A). SALS에 의해 분류된 C. elegans EV 샘플 이벤트의 히스토그램은 모든 제제가 ~103에서 피크임을 보여준다(도5B). 그림 5: C. elegans EV는 광 산란 특성에 의해 명확하게 정의됩니다. (A) C. 예쁜꼬마선충 EV의 3가지 생물학적 복제물에서 SALS 사건의 히스토그램. 전체 샘플 이벤트의 ~ 80%는 좁고 명확하게 정의된 채우기 내에 포함됩니다. 나노입자 추적 분석과 유사하게, C. elegans EV의 크기 분포가 단분산임을 보여준다. 샘플을 희석하는 데 사용되는 S 기저 완충제의 히스토그램은 비교를 위해 도시됩니다. (b) C. 예쁜꼬마선충 및 인간 세포 배양 EV의 굴절 특성을 비교하여 본 문헌에 기재된 방법과 정제하였다. 두 EV 유형 모두 유사한 단거리 및 장거리 광 산란 분포(SALS 및 LALS)를 일관되게 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. DI-8-ANEPPS는 C. elegans EV를 강력하게 라벨링하여 C. elegans 및 세포 배양 유래 샘플 모두에서 전체 이벤트의 대부분을 일관되게 강조합니다. 교정 비드 및 컨트롤은 그림 6A에표시됩니다. 개별 FACS 산란플롯은 200,000마리의 동물(#1)과 500,000마리로부터 제조된 2마리로부터 제조된 C. 예쁜꼬마선충 샘플로부터 도시된다(도6B). 100 mL(#1) 또는 200 mL(#2,3)의 세포 배양으로부터의 EV도 분석하였다(도6C). C. 예쁜꼬마선충 및 세포 배양 유래 샘플 은 0.05% 트리톤-X 100 및 광 초음파 처리 시 사라진 풍부한 형광 이벤트를 보였다. 이것은 표지된 사건이 세제-민감성 고체 지단백질 응집체보다는 세제 의약 부당한 인지질 구조(vesicles)임을 보여준다. EV 풍부도는 세제(-)가 없는 분획과 세제(+)에서 염료 전용 제어의 이벤트를 뺀 DI-8-ANEPPS+ 게이트의 이벤트 수 간의 차이로 계산됩니다. 명확성을 위해 그림 6B 및 도 6C에 개별적으로 제시된 데이터는 도 6D 및 도 6E의막대 그래프로 요약됩니다. 정제된 EV의 풍부도는 C. 예쁜꼬마선충과 세포 배양 유래 제제 사이에 유의하게 다르지않았다(도 6F). 그림 6: EV 풍부도를 계산하는 데 사용되는 유세포 분석 데이터의 예. (A)이벤트 수를 샘플 간에 직접 비교할 수 있도록 하려면 버퍼 전용과 버퍼 및 염료 전용 컨트롤은 EV 샘플 분수와 동일한 유량 및 수집 시간에 실행되어야 합니다. DI-8-ANEPPS 게이트에는 이벤트가 거의 없습니다. (B) C. elegans에서DI-8-ANEPPS 및 세제 처리 프로토콜의 대표적인 결과. 3개의 생물학적 복제가 도시된다. 생물학적 복제 #1 200,000마리의 동물로부터 제조하였고, #2 500,000마리의 동물로부터 #3 제조하였다. 세제 처리와 전기 의 실종은 모든 경우에 분명하다. (C)DI-8-ANEPPS 및 인간 세포 배양 조절 배지를 이용한 세제 처리 프로토콜의 대표적인 결과. 생물학적 복제#1 및 #2 200 mL의 컨디셔닝된 매체로부터 제조하였고 생물학적 복제 #3 100 mL로부터 제조하였다. (D) C. elegans EV의 세 가지 생물학적 복제물로부터 수집된 데이터의 바 그래프. 오류 막대 = S.E.M. 치료 사이에 쌍으로 된 두 개의 꼬리 t-검정. = p 값 < 0.001. (e)세포 배양 유래 EV의 3가지 생물학적 복제로부터 수집된 데이터의 바 그래프. 치료 사이의 쌍 두 꼬리 t 테스트. = p 값 < 0.001(F)μL당 염료 표지된 세제 민감성 이벤트의 수는 C. 예쁜꼬마선충 및 세포 배양의 모든 생물학적 복제에 대해 계산되었다. 두 EV 샘플 소스 간의 값은 크게 다르지 않습니다. 치료 p 값 = 0.685 사이의 쌍두 꼬리 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 표 1은 분석된 각 샘플 유형의 전체 4.5 μL에 대한 원시 실험 값을 포함합니다. 500,000마리의 동물로부터 정제된 EV 분획으로부터 수집된 총 이벤트 수는 버퍼단독으로 수집된 입자의 배경 수보다 10-20배, 200,000마리의 동물에서 정제된 분획은 버퍼 단독으로 약 2배 많은 이벤트를 포함하였다. DI-8-ANEPPS+ 게이트 내의 이벤트 수도 각 샘플에 대해 표시됩니다. 이러한 메트릭을 스프레드시트로 가져와 위에서 설명한 것과 같이 염료 양성, 세제에 민감한 EV수를 계산할 수 있습니다. 예를 들어, 첫 번째 C. 예쁜꼬마선충의 1mL에 있는 EV의 수는 다음과 같이 계산될 것입니다: (18,974 – 3,853 – 1,487) x (10/4.5) x 1,000 = 30,297,778. 표 1: 표화된 유세포 분석 데이터. 그림 6에 표시된 데이터는 스프레드시트로 표시됩니다. 각 샘플에 대해 총 이벤트 및 DI-8-ANEPPS+ 게이트이벤트가 표시됩니다. 각 생물학적 복제는 프로토콜에서 #1-3샘플의 순서로 배열된다. 이 측정은 500,000마리의 동물 또는 200 mL의 세포 배양 조절 배지로부터 제조된 C. elegans 샘플로부터 수집된 총 이벤트 수가 버퍼 단독으로 200,000마리의 동물로부터 생물학적 복제가 정제된 동안 버퍼에 의해 수집된 입자의 배경 수에 비해 10-20배였다는 것을 밝힙니다. DI-8-ANEPPS+ 게이트 내의 이벤트 수도 각 샘플에 대해 표시됩니다. 이러한 메트릭을 스프레드시트로 내보내 총 전기 자동차 수를 계산할 수 있습니다. 이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).

Discussion

EV 분야의 근본적인 과제는 다양한 EV 서브타입2를분리하는 것입니다. 여기서 설명된 방법은 여과, 차동 원심분리, 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 작은 EV의 순수한 집단을 생성하기 때문에 ~ 100 nm EV는 이전에 생리학적으로 관련된 통신 경로에서 외부 환경 및 기능으로 분비되는 것으로나타났다. 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제된 EV는 이러한 EV 서브클래스가 유사하게 크기 때문에 여전히 엑소좀과 작은 마이크로베시클의 혼합물일 수 있다. 척추동물 EV 서브클래스는 일반적으로 면역침전에 의해 분리되는데, 왜냐하면 이 방법은 선택적 막 단백질 마커에 결합을 통해 EV를 분리하기 때문이다. 기재된 방법은 C. elegans EV 막 마커 단백질의 식별을 용이하게 한다. 따라서, 미래에는 유사한 면역 침전 방법을 통해 작은 EV 서브클래스를 더욱 분리할 수 있다. 이론적으로, 면역 침전은 대장균 EV가 항체와 상호 작용해서는 안되기 때문에 잘 먹는 벌레에서 전기를 격리할 수 있었습니다. 더 큰 EV 서브 클래스 (>200 nm)의 단백질 과 유전화물을 확인하는 데 관심이있는 연구원은 0.22 μm 여과 단계를 건너 뛰고 상층이 아닌 펠릿을 분석하여 그렇게 할 수 있습니다. 대형 전기 EV의 단백질과 유전적 화물풍부를 밝히는 것은 C. elegans 분비체를 통해 기능하는 생리적 과정에 대한 보다 포괄적인 이해를 확립할 것입니다. C. elegans EV는 환경으로 분비되는 것 외에도 조직 간에 내부적으로 전달됩니다. 따라서 이러한 메서드는 총 C. elegans EV의 하위 집합만 격리합니다. 그러나 내부 전기 자동차에서 전기 를 분리하는 방법이 없기 때문에 내부 전기 의화물 발견은 불가능합니다. 이 외부 분비 된 EV 서브 세트의화물 분석은 내부 EV를 표지 할 수있는 잠재적 인 일반 EV 단백질 마커를 식별하는 수단을 제공합니다.

EV 준비의 규모는 실험의 요구에 따라 달라집니다. 총 500,000명의 청년성인이 유세포 분석, LC-MS-MS 및 RNAeq 분석을 병렬로 수행하기에 충분한 EV를 제공합니다. 이 숫자는 실험 적 필요에 따라 확장하거나 축소 할 수 있습니다. 스케일업을 위한 가장 큰 실용적인 요소는 10cm 의 높은 성장 플레이트의 수입니다. 500 μL의 200 μL농축 NA22 배양으로 제조된 고성장 플레이트는 L1 애벌레 단계부터 성인첫날까지 ~50,000명의 성인을 지원할 것이다. 따라서, 500,000명의 성인을 대상으로 실험을 실시하기 위해서는 L1의 인구를 생성하는 플레이트 1개, 표백을 위한 성인을 생성하는 플레이트 2개, 실험 동물의 성장을 위한 플레이트 10개 등 13개의 고성장 판이 필요합니다. 이러한 메트릭은 고성장 플레이트의 종자 및 세균 성장 조건에 따라 다발성된다. 따라서 모든 판을 표준화 된 방식으로 만들고 알려진 양의 동물로 교정하는 것이 좋습니다.

벌레는 재배 과정에서 두 단계로 계산됩니다 : 1) 접시에 벌레를 시종하기 전에 2) 컨디셔닝 된 매체를 생성하기 전에. 동물 재배 밀도는 행동, 발달 및 스트레스 반응15,,16,,17,,18및 EV 화물에도 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 따라서 일관된 재배 밀도를 위해서는 웜 개체군을 정확하게 추정할 필요가 있다. 9방울로 웜 수를 정량화하면 인구 추정에 대한 통계적 신뢰도가 부여됩니다. 각 방울을 개별적으로 처리하는 것이 필수적이며, 각 드롭 사이에 소용돌이가 일어나고 파이펫을 웜 현탁액에 동일한 거리를 삽입하는 것이 필수적입니다. 이러한 예방 조치를 취하면 S.E.M. 값이 전체 인구의 ~5-10%를 차지합니다. 웜 개체수가 20% 이상인 경우 뭔가 엉망이 되었습니다.

24 시간 세균없는 잠복기 후, 젊은, 야생 형 C. 예쁜 꼬마는 세균성 잔디에 추가 즉시 크롤링. 이것은 배양이 그들의 건강에 가혹하게 영향을 미치지 않는다는 것을 표시합니다. 그러나, 이 단계는 동물의 생리학에 영향을 미치므로 EV 화물의 조성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 매우 아픈 유전자형 또는 오래된 동물과 함께 작업 할 때 인큐베이션 단계 후에 생존력을 확인하는 것이 필수적입니다. 모든 동물이 배양에서 살아남지 못하면 실험 인구 크기를 늘리고 배양 시간을 줄입니다. 많은 양의 컨디셔닝 된 매체로 작업 할 때 재생 된 니트로 셀룰로오스로 만든 필터가있는 교반 셀 농축기를 사용하는 것이 더 실용적입니다. 전기 자동차는 다른 필터 유형14와같이 강력하게이 필터 화학에 결합하지 않습니다.

조절된 매체로부터 회수된 총 단백질의 비율과 제제를 만들기 위해 배양된 동물의 수의 비율은 유용한 지표이다. 이 비율이 예상보다 훨씬 높은 경우, 인구 추정이 꺼져 있거나 동물이 사망하고 조건부 미디어에서 악화되었을 수 있습니다. 이 비율이 예상보다 훨씬 낮은 경우, 다음 일부 단백질은 농도 과정에서 필터에 손실 되었을 수 있습니다. FACS 방법은 준비 과정에서 EV를 직접 정량화하지만 이 메트릭은 프로세스 초기에 샘플 이상을 강조 표시할 수 있으므로 유용합니다. EV 제제의 품질을 확인하는 또 다른 유용한 방법은 도 4D에나타난 바와 같이 전송 전자 현미경검사법이다. 전송 전자 현미경 검사법에 대한 프로토콜은 길이로 인해이 방법 문서에 공식적으로 포함되지 않지만, 표준 방법에 의해 수행 될 수있다. EV 준비의 품질을 평가하기 위한 FACS에 대한 무료 방법으로 적어도 처음에는 이러한 유형의 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 최상의 결과를 위해 갓 배출된 폼바르-카본 그리드를 사용하고 우라알 아세테이트 대신 2% 인산화산으로 시료를 염색합니다.

DI-8-ANEPPS는 EV 멤브레인에 정량적으로 라벨을 붙이는 것으로 나타났기 때문에 선택되었으며, 인간 생검 샘플 및 리포좀25를사용하여 다른 일반 EV 염료를 능가합니다. 측정은 각 샘플에 대한 수집 시간의 3 분만 복용, 빠르다. 세제에 민감한 전기 자동차의 정량화는 EV와 고체 지단백 응집체 사이의 근본적인 물리적 구별을 활용하기 때문에 직접적인 기능적 중요성을 가지고 있습니다. 중요한 것은, 이 방법은 총 단백질의 양 또는 비 EV 응집체의 수에 의해 영향을 받지 않으므로 다른 정제 방법을 통해 얻어진 EV를 편견 없는 방식으로 정량화할 수 있다. 여기서 설명하는 FACS 검증 EV 메트릭은 정제된 EV의 생리적 영향을 입증하는 연구에 특히 도움이 될 것입니다. 또한 일반적인 EV 필드를 통해 FACS 방법론을 보편적 인 메트릭으로 확립하여 절대 EV 풍부도를 연구 전반에 걸쳐 직접 비교할 수 있습니다. 바이탈 염료는 C. elegans EV에 라벨을 붙일 수 있지만 Di-8-ANEPPS로 표시된 EV만큼 밝지 않습니다.

이 정화 접근법은 살아있는 벌레의 몸 밖에서 전기 EV의 활성 분비를 활용합니다. 이는 C. elegans EV가 LC-MS 및 RNAeq 분석26을통해 수백 개의 단백질 및 RNA 화물을 식별하기에 충분한 세포 배양으로부터와 유사한 순도 및 풍부함으로 단리될 수 있도록 한다. 따라서, C. 예쁜꼬마선충 연구에 사용할 수 있는 시약의 큰 라이브러리는 EV 화물 조성물에 대한 유전적 및 생리적 교란의 영향을 조사하기 위해 활용될 수 있다.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 감사하게 도닉 테르조풀로스 웜 플레이트와 시약을 인정; N2 선충 라인에 대한 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무실에서 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC) (P40 OD010440) ; 루시아 Vojtech, 박사, 나노 입자 추적 분석에 대한 지원; 제시카 영, 박사, 마리 클레어, MD, 박사, hiPSC 유래 뉴런 컨디셔닝 세포 매체; TEM 이미징에 대한 지원을 위한 와이 팡. 이 작품은 MK와 NIH 교부금 AG054098 JCR에 NIH 교부금 P30AG013280에 의해 지원되었다.

Materials

0.22 filters units Genesee 25-233 For clairifying the conditioned media from debris
1% solution of Triton X-100 ThermoFisher HFH10 Add this to 0.05 % to lyse EVs
10 cm high growth plates N/A N/A For cultivating large populations of worms
2-liter bottom baffled flasks ThermoFisher 4110-2000PK For conducting size exclusion separation of EVs
40 μm mesh Amazon CMY-0040-C/5PK-05 Use this to separate adult worms from larval stages
5 μm mesh Amazon CMN-0005-C Use this to separate L1s from other worm stages
6 cm normal growth medium worm cultivation plate N/A N/A For cultivating small populations of worms
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C7715 For concentrating the size exclusion elute
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C78144 For concentrating the conditioned media
Apogee A50 flow cytometer Apogee This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles
ApogeeMix Apogee 1493 Assess light scatter and fluorescence performance of FACS
DI-8-ANEPPS ThermoFisher D3167 Add this at 20 uM to label EVs
Disposable chromatography Column BioRad 7321010 For conducting size exclusion separation of EVs
Geletin MilliporeSigma G9391-100G To treat pipette tips so that worms do not stick
HALT protease inhibitor ThermoFisher 87785 Add to EV sample to prevent protein degradation
Low-protein binding collection tubes ThermoFisher 90410 Use these for EV samples
NaCl Sigma S7653-1KG For sucrose floatation of worms
S Basal buffer N/A N/A Recipe in WormBook
Sepharose CL-2B resin MilliporeSigma CL2B300-100ML For conducting size exclusion separation of EVs
Small orbital shaker ABC Scientific 83211301 Use this for worm S Basal incubation
Sucrose Sigma S8501-5KG For sucrose floatation of worms
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Referencias

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Russell, J. C., Postupna, N., Golubeva, A., Keene, C. D., Kaeberlein, M. Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (157), e60596, doi:10.3791/60596 (2020).
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