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Biología

Purification et analyse de Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Published: March 31, 2020
doi:
10.3791/60596
, , , ,
1Department of Pathology,University of Washington

Summary

Cet article présente des méthodes pour générer, purifier et quantifier les vésicules extracellulaires Caenorhabditis elegans.

Abstract

La sécrétion de petites vésicules liées à la membrane dans l’environnement externe est un processus physiologique fondamental de toutes les cellules. Ces vésicules extracellulaires (VE) fonctionnent à l’extérieur de la cellule pour réguler les processus physiologiques mondiaux en transférant des protéines, des acides nucléiques, des métabolites et des lipides entre les tissus. Les véhicules électriques reflètent l’état physiologique de leurs cellules d’origine. Les véhicules électriques sont impliqués pour avoir des rôles fondamentaux dans pratiquement tous les aspects de la santé humaine. Ainsi, les protéines EV et les cargaisons génétiques sont de plus en plus analysées pour les biomarqueurs de la santé et des maladies. Cependant, le champ EV n’a toujours pas un système de modèle d’invertébrés tractable qui permet l’étude de la composition de la cargaison ev. C. elegans est bien adapté à la recherche evpique parce qu’il sécrète activement des véhicules électriques en dehors de son corps dans son environnement externe, permettant un isolement facile. Cet article fournit toutes les informations nécessaires pour générer, purifier et quantifier ces véhicules électriques C. elegans sécrétés sur le plan environnemental, y compris la façon de travailler quantitativement auprès de très grandes populations de vers synchronisés par âge, de purifiant les véhicules électriques et d’un protocole de cytométrie des flux qui mesure directement le nombre de véhicules électriques intacts dans l’échantillon purifié. Ainsi, la grande bibliothèque de réactifs génétiques disponibles pour la recherche C. elegans peut être exploitée pour étudier les impacts des voies génétiques et des processus physiologiques sur la composition de la cargaison EV.

Introduction

La sécrétion de vésicules extracellulaires (VE) liées à la membrane facilite les processus physiologiques mondiaux en transportant activement des cargaisons spécifiques de protéines, d’acide nucléique, de métabolites et de lipides entre les cellules1. Les cellules sécrètent des véhicules électriques qui couvrent un continuum de tailles allant de 2 m ou plus à aussi petite que 20 nm2. Les petits véhicules électriques (200 nm) sont de plus en plus étudiés en raison de leur implication dans les processus pathologiques, y compris les troubles métaboliques, le cancer, les maladies cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives3,4,5. Il a également été démontré que ces pathologies influencent la teneur en protéines et en génétique des cargaisons de petits véhicules électriques. Par conséquent, les signatures de biomarqueur de la pathologie sont de plus en plus découverts par des méthodes de découverte de fret EV telles que LC-MS-MS et RNAseq6,7,8,9.

C. elegans a été un modèle utile d’invertébrés pour identifier les voies de signalisation EV conservées de façon évolutive. Par exemple, une flippase C. elegans a d’abord été montré pour induire la biogenèse de EV dans les embryons de C. elegans, et l’homolog humain a été montré pour influencer la libération de EV dans les cellules humaines10,11. Les véhicules électriques C. elegans auraient été munis de signaux hérisson nécessaires au développement des cuticules. La livraison de hérisson et d’autres morphogènes a été montré pour jouer un rôle majeur de développement des véhicules électriques, et il est conservé dans le poisson zèbre, les souris et les humains12,13,14,15. C. elegans est bien adapté à la découverte de biomarqueurs EV parce qu’il sécrète des véhicules électriques à l’extérieur de son corps qui fonctionnent dans la communication d’animaux à l’animal16,17 (figure 1A). Cependant, la méthodologie établie dans le cadre d’une étude précédente ne peut pas être utilisée parce que la source de nourriture E. coli des nématodes sécrète également des véhicules électriques18. Dans cette méthode, la majeure partie de l’échantillon est composée de contamination par E. coli, ce qui limite la puissance des approches protéomiques ou RNAseq pour la découverte de cargaisons de C. elegans EV. Les méthodes décrites ici ont été développées pour produire des véhicules électriques C. elegans très purs à des niveaux d’abondance caractéristiques des expériences typiques de culture cellulaire et ainsi faciliter les approches omics pour la découverte de biomarqueur EV.

De grandes populations de vers sont nécessaires pour générer un nombre suffisant de véhicules électriques pour l’analyse des cargaisons. Par conséquent, des méthodes pour la culture quantitative de grandes populations de C. elegans synchronisés sur le développement sont également incluses. Typiquement, quand un grand nombre de vers sont nécessaires pour des expériences, ils sont cultivés dans les médias liquides. Bien que cela soit efficace pour générer de grandes populations de vers, la physiologie des animaux est considérablement différente des vers cultivés dans des conditions standard sur les plaques d’agar moyennes de croissance des nématodes (NGM). Les animaux cultivés dans le liquide se développent plus lentement, sont plus minces, montrent l’hétérogénéité développementale, et sont soumis à un degré élevé de variabilité de lot. Par conséquent, nous présentons un moyen simple mais efficace pour la culture quantitative de grandes populations de C. elegans synchronisés développementnellement à l’aide de plaques de croissance de 10 cm de haut. La composition médiatique des plaques à forte croissance comprend plus de peptone que les plaques NGM régulières et sont ensemencées par la souche E. coli NA22 qui pousse plus solidement que l’OP50.

Les progrès de la technologie de cytométrie des débits (FACS) ont permis l’analyse directe des véhicules électriquesindividuels 20,21, permettant la quantification des véhicules électriques sans les limites inhérentes à d’autres méthodes. Des travaux antérieurs ont montré que la protéine n’est pas un proxy utile pour l’abondance de EV parce que différentes méthodologies de purification aboutissent à des rapports EV-protéine sensiblement différents22. Les fractions EV extrêmement pures contiennent relativement peu de protéines, ce qui rend difficile la quantification des échantillons avec des gels BCA ou Coomassie. L’analyse occidentale peut identifier les différences relatives des protéines individuelles, mais ne peut pas identifier le nombre de véhicules électriques dans l’échantillon. La forte quantification du nombre de véhicules électriques par l’analyse de suivi des nanoparticules est entravée par sa plage étroite de signal-bruit, son incapacité à différencier les véhicules électriques et les agrégats solides, et l’absence de transférabilité des méthodes entre les instruments aux spécifications différentes23. Par conséquent, cet article contient également une procédure cytométrique de débit généralisable pour discriminer et quantifier les véhicules électriques.

Protocol

1. Préparation Ajouter 2 g de gélatine à 100 ml de dH2O et chauffer au micro-ondes jusqu’à ce qu’il commence à bouillir. Ensuite, remuer et laisser refroidir pendant 20 min. Passez la solution à travers un filtre de 0,22 m et distribuez-les en tubes stériles. Traiter les pointes de pipette avec de la gélatine immédiatement avant l’utilisation en tuyautant et en expulsant la solution de gélatine. Les pourboires traités peuvent être utilisés immédiatement ou stockés. Découpez la membrane d’un filtre à capuchon stérile. Mouiller un carré de 20 cm de tissu en maille de nylon de 5 m et placer autour du dessus d’un filtre à capuchon stérile. Fixez-le avec plusieurs élastiques épais.CAUTION: Examiner attentivement le tissu pour s’assurer qu’il n’y a pas de plis. Ceux-ci font des lacunes d’air qui entravent l’aspiration. 2. Calculer les grandes populations de vers(figure 1A) Vortex et pipette 10 L de suspension de ver sur un couvercle de plaque de culture de ver ou une glissière en verre. Répétez ce processus 3x. Enregistrez le nombre d’animaux à chaque goutte. Ajuster la suspension du ver à deux animaux par L. Vortex la suspension et la pipette neuf gouttes (10 l) sur une glissière ou un couvercle de plaque. Comptez manuellement le nombre d’animaux. Enregistrez le nombre d’animaux à chaque goutte. Calculez l’erreur moyenne et standard de la moyenne (S.E.M.) en pourcentage de chaque population de vers. Calculer le nombre total d’animaux dans chaque population en divisant la valeur moyenne par 10 l, puis en se multipliant par le volume total de la suspension du ver en L. Figure 1 : Aperçu de la procédure pour générer, quantifier et purifier les véhicules électriques C. elegans. (A) Schéma pour compter de grandes populations d’animaux. (B) Schéma pour la production de vers pour la récolte des véhicules électriques. (C) Schéma pour purifier les véhicules électriques de C. elegans supernatent. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 3. Cultiver C. elegans pour EV Purification Générer une grande population de développement synchronisé C. elegans. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous. Ajouter un seul animal sur une plaque de support de croissance normale de 6 cm. Incuber pendant deux générations, puis laver les animaux sur deux plaques moyennes à forte croissance. Incuber jusqu’à ce que les vers ont épuisé la nourriture. Filtrer les vers L1 avec un maille en nylon de 5 m préparé à l’étape 1.4. Placez le bouchon à vis sur la bouteille stérile, commencez le vide et versez les vers sur le filtre. Passer le même volume du milieu sur les agrégats de ver sur le filtre. Quantifier les vers et calculer le nombre total (voir étape 2). Les vers récemment affamés (lt;24 h) cultivés sur une plaque à forte croissance se traduisent par environ 80 000 larves de L1. Centrifuge L1 larves à 2.000 x g pendant 3 min. Résuspendent à 100.000 animaux par mL. Placez 50 000 animaux par plaque à forte croissance. Cultivez les animaux à 20 oC jusqu’à ce qu’ils soient des adultes graviés (environ 72 h). Blanchir les adultes gravidés par des moyens standard et permettre aux embryons d’éclore dans 10 ml de solution basale S avec 2,5 g/mL de cholestérol. Quantifier les larves de L1 (voir l’étape 2) puis ajouter 50 000 vers à chaque plaque à forte croissance. Cultivez des assiettes à 20 oC jusqu’à ce que les animaux soient de jeunes adultes. Préparez C. elegans pour la génération secret. Laver les vers des assiettes en ajoutant 15 ml de M9 stérile avec une carbenicilline de 50 g/mL à chaque plaque à forte croissance. Laisser reposer les plaques saturées pendant 5 min. Déloger les vers en encerclant le tampon autour de la plaque. Évitez de sloshing. Verser le tampon de chaque plaque dans un tube conique séparé de 50 ml. Répéter l’étape de lavage 2x de plus pour un total de 45 ml de tampon par plaque. Laissez les vers se contenter de 15 min. Décant le supernatant et ajouter 50 ml de tampon M9 frais au tube. Répétez l’opération pour un total de 4x. Flottez les vers sur le dessus d’un saccharose de 30% et récupérez les animaux dans la solution S Basal24. Réutilisez brièvement les vers dans 15 ml de NaCl glacé de 100 mM, ajoutez 15 ml de saccharose glacée à 60 % et inversez-vous pour mélanger. Avec une pipette en verre couche délicatement 5 mL de glace froide 100 mM NaCl sur le dessus du mélange de saccharose. Centrifugeuse à 1500 x g pendant 5 min. Les vers seront concentrés à l’interface entre le NaCl et le saccharose. Pipette doucement les animaux de l’interface dans un nouveau tube conique de 50 ml. Ajouter la solution S Basal à 50 ml. Laisser les vers s’installer 5 min. Décant le supernatant et ajouter frais 50 ml de solution S Basal. Répétez cette opération au moins 3x. Quantifier le nombre de vers tel que décrit à l’étape 2. Réutilisez les vers à une densité d’un animal par lil avec une solution stérilienne S Basal contenant 2,5 g/mL de cholestérol et 50 m de carbenicilline. Pour préparer l’échantillon pour la génération de secretome, ajouter jusqu’à 400 ml de la suspension à un flacon stérile de 2 L déconcerté au fond. Placez les flacons sur le rotateur circulaire dans un incubateur de 20 oC à 100 tr/min pour 24 h. 4. Ev Purification Récolte et fractionnement Retirer le flacon de 2 L de vers de l’incubateur et les pelleter les animaux dans des flacons coniques de 50 ml (500 x g pendant 2 min). Verser le supernatant à travers un filtre à vide de 0,22 m pour enlever les débris de particules.REMARQUE : À ce stade, le supernatant filtré contenant le sécréome et les vésicules peut être stocké à -80 oC. Comptez le nombre d’animaux décrits à l’étape 2. Déterminer la viabilité des vers en plaçant une goutte de vers suspendus sur une pelouse bactérienne. Attendez 15 min, puis marquez les animaux comme se déplaçant, paralysés ou morts. Concentrez le supernatant filtré de 0,22 m à 700 ll à l’aide d’unités de filtre nitrocellulose régénérées de 10 kDa. Ajouter la solution basal S de 150 L, puis la pipette sur le filtre et le vortex. Répéter 2x. Centrifuge le supernatant concentré à 18.000 x g pendant 20 min à 4 oC et transférer le supernatant dans un nouveau tube. Cette étape élimine tout débris potentiel ou particules plus grosses qui auraient pu s’accumuler lors de la manipulation. Ajouter le cocktail inhibiteur de la protéase et EDTA selon les instructions du fabricant.REMARQUE : À ce stade, le supernatant concentré contenant le sécréome et les vésicules peut être stocké à -80 oC. chromatographie d’exclusion de taille Verser de la résine d’agarose de 80 à 200 m (plage de fractionnement de la taille des pores de 70 000 à 40 000 000 kDa pour les protéines globulaires) dans une cartouche de colonne de débit de gravité vide. Flux S Basal solution jusqu’à ce que le lit de résine est emballé à un volume final de 10 mL.REMARQUE : Si trop de résine est versée dans la cartouche de colonne, dispersez le haut de la colonne et retirez l’excédent à l’égard d’une pipette. Passer 40 ml de solution S Basal filtrée stérile à travers la colonne et la laisser couler sous gravité.AVERTISSEMENT : Vérifiez que la résine n’est pas dérangée. Laissez le tampon s’écouler jusqu’à ce que le dessus de la résine ne soit pas submergé, puis plafonner le bas de la cartouche de colonne. Placez un tube de collection sous la colonne. Retirez le bouchon placé sur la cartouche. Ajouter le sécréome concentré obtenu dans l’étape 2.1 dropwise au sommet du lit de colonne. Pipette 1 mL de solution S Basal dans le sens de la chute. Placez un tube de collecte frais sous la colonne. Remplissez lentement le réservoir de colonne supérieure avec la solution basale de 5 mL S pour ne pas déranger la résine. Recueillir les 2 premiers ml d’eluate puis changer rapidement les tubes et recueillir les 4 ml suivants. C’est la fraction qui est enrichie pour les véhicules électriques. Concentrez l’eluate à 300 L avec un filtre regénéré de nitrocellulose 10 kDa coupé moléculaire (MWCO) et le retentate de transfert dans un tube de microcentrifuge à faible liaison. Laver la membrane de filtre 2x avec 100 L de solution S Basal en vortexing pour 20 s et en canalisation de la mémoire tampon à travers le filtre. Ajouter à l’échantillon initial pour un volume final de 500 ll. Ajouter le cocktail inhibiteur de la protéase selon les instructions du fabricant. Effectuez immédiatement les expériences en aval (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS, etc.) ou magasinez à -80 oC. 5. Quantification de cytométrie de flux de l’abondance de EV Préparation de teinture Préparer un stock de 10 mM de DI-8-ANEPPS à l’aide de DMSO frais. Distribuer dans les aliquots de 10 L et entreposer à -20 oC. Préparer une solution de travail de 1 mM en ajoutant 90 L de PBS filtré stérile à un tube avec 10 L de stock de colorant. Préparation expérimentale de l’échantillon Ajouter 840 L de solution S Basal dans un tube de microcentrifuge. Ajoutez ensuite 60 L des véhicules électriques purifiés générés dans la section 4.2 et le vortex. Aliquot 300 L de l’échantillon en deux nouveaux tubes de microcentrifugeuse. Il existe maintenant un ensemble expérimental de trois tubes contenant 300 L de véhicules électriques dilués chacun. Étiqueter les tubes #1-3. Pour les échantillons #2 et #3 ajouter 7 l ‘L du stock DI-8-ANEPPS préparés dans 5.1.2. Ajouter ensuite 7 L de 1% Triton-X 100 au tube #3. Mélanger chaque tube en vortexing. L’échantillon sonicate #3 en plaçant la pointe sonicateur au milieu de l’échantillon et en pulsant 10 fois à 20 % de puissance 30 % du cycle de droits.CAUTION : Assurez-vous que la pointe de la sonde sonicateur est au milieu de l’échantillon afin que la génération de mousse soit réduite au minimum. La mousse peut compromettre l’échantillon en faisant agréger les véhicules électriques. Ajouter 300 L de solution S Basal à deux tubes de microcentrifuge. Ajoutez 7 L du réactif de travail DI-8-ANNEPS préparé à l’étape 5.1 au deuxième tube et à l’étiquette « Dye Only ». Étiquetez l’autre tube “Buffer Only”.REMARQUE : Préparez les échantillons de contrôle de Dye Only et Buffer Only et les échantillons expérimentaux avec la même source S Basal. Incuber les échantillons loin de la lumière directe et à température ambiante pendant 1 h. Mener des expériences FACS. Réglez le filtre d’excitation FACS à 488 nm (bleu) et le filtre d’émission à 605 nm (orange). Réglez le débit à 1,5 ll par minute. Exécuter le mélange d’étalonnage nanobead FACS (facultatif mais recommandé). Exécuter chaque échantillon sur une machine FACS pendant 3 min (180 s). Notez les temps de fonctionnement exacts en quelques secondes. Analyser les données FACS. Ouvrez les fichiers avec le logiciel d’analyse FACS. Passez de l’axe Y à 488-Org (Zone) en cliquant sur l’Axe,en sélectionnant parmi le menu déroulant. Définissez une porte rectangulaire à partir du sommet de l’intrigue, allant du niveau SALS 102 à 104 (particules de taille de 300 nm). Étendre la porte vers le bas jusqu’à ce qu’elle contienne 2,5 % du total des événements. Nommez la porte “DI-8-ANEPPS” événements. Quantification de l’abondance de l’échantillon de VE Copiez cette porte et collez-la sur les deux autres échantillons de votre ensemble expérimental ainsi que les commandes Buffer Only et Dye Only. Exporter l’analyse vers une feuille de calcul. Si les échantillons de FACS n’ont pas été exécutés pour les 3 min (180 s) recommandés, normalisez tous les nombres d’événements dans l’échantillon aux événements pour 180 s. Par exemple, si un échantillon a été exécuté pour 250 s, le numéro d’événement DI-8-ANEPPSMD est réduit de 250 s/180 s. Supprimez les événements de fond de teinture en soustrayant le nombre d’événements DI-8-ANEPPSMD dans le contrôle de teinture seulement de ceux de l’échantillon #2. Supprimer les événements de fond d’isotype en soustrayant le nombre d’événements DI-8-ANEPPSMD dans l’échantillon #1. Éliminez les événements insensibles aux détergents en soustrayant le nombre d’événements DI-8-ANEPPSMD dans les #3 d’échantillons. Cette valeur est le nombre de véhicules électriques de bonne foi. Calculer le nombre de véhicules électriques dans l’échantillon de 1 l en divisant la valeur calculée à l’étape 5.5.5 par le volume analysé dans le volume analysé dans l’étape 2.5. Multipliez cette valeur par le nombre de L restant dans la préparation de EV. C’est le nombre de véhicules électriques disponibles pour l’analyse en aval. Figure 2 : Schéma de préparation d’échantillon de cytométrie d’écoulement pour quantifier l’abondance de EV. (A) La préparation de EV est divisée en trois échantillons identiques. L’échantillon no 1 est le contrôle négatif No Dye. DI-8-ANEPPS est ensuite ajouté aux échantillons #2 et #3. Triton-X 100 est ensuite ajouté à l’échantillon #3. La flèche verte indique que seul l’échantillon #3 est ensuite sonicated. Les données du flux aident à déterminer le nombre absolu de véhicules électriques sensibles au détergent dans les échantillons de FACS, puis à calculer l’abondance des véhicules électriques dans la préparation totale. La porte pour déterminer les événements de teinture positif est définie avec l’échantillon #1, qui ne contient pas de colorant. L’écriture rouge sur les données de la feuille de calcul est d’illustrer que les événements de teinture positif de l’échantillon traité par détergent sont soustraits de l’échantillon avec du colorant. (B) Équations pour quantifier les véhicules électriques dans un échantillon analysé par le SRV et calculant le nombre total de véhicules électriques dans l’échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Representative Results

Un schéma pour les processus nécessaires à la génération et à la purification des véhicules électriques est indiqué à la figure 1. Les heures typiques requises pour terminer chaque étape sont indiquées en dessous. La figure 2 montre un schéma de préparation d’échantillons pour l’analyse du SCF à l’aide de DI-8-ANEPPS(figure 2A) ainsi que des calculs nécessaires pour estimer le nombre total de véhicules électriques dans un échantillon(figure 2B). Les résultats représentatifs de 10 répliques biologiques sont présentés à la figure 3A. La variabilité entre les répliques n’est pas significative et le S.E.M. typique de la taille de la population est un peu plus de 10%(figure 3B). Le filtrage des vers et la culture sur les plaques fraîches à forte croissance généreront une grande population d’adultes gravidés adaptés à la synchronisation de l’eau de Javel. Une seule plaque affamée transformée de cette façon peut produire une population expérimentale de 1 x 106 ou plus de progéniture synchronisée parce que chaque adulte gravié contiendra environ 10 œufs. Il est possible de maintenir de grandes populations de populations synchronisées sur le plan du développement en filtrant les œufs et les larves à travers un filtre de 40 m pour obtenir des véhicules électriques d’animaux plus âgés. Les adultes retenus sont transférés dans des assiettes fraîches à forte croissance à une densité de 20 000 animaux par assiette. Ce processus a été répété tous les 2 jours. La figure 3C montre trois répliques biologiques de populations de vers déplacées à travers trois transferts de plaques. Le transfert d’animaux entre les plaques entraîne une perte d’environ 10 % d’animaux(figure 3C) alors qu’environ 20 % des animaux sont perdus dans l’étape de flottaison du saccharose(figure 3D). Figure 3 : Quantification de grandes populations de C. elegans pour l’analyse des véhicules électriques. (A) Une comparaison du nombre de vers de stade larvaire L1 isolés d’une seule plaque de croissance élevée récemment affamée ( lt;24 h). Les valeurs de chacune des 10 répliques biologiques sont tracées. Le résumé de tous les points de données des 10 répliques est également présenté comme une parcelle de violon et une barre avec S.E.M. Cela montre qu’une seule plaque de vers récemment affamés donnera 80 000 vers de stade larvaire L1. (B) Le S.E.M. des 15 différentes mesures de population de plaques dans le panneau A tracé comme points individuels. En général, le S.E.M. est légèrement supérieur à 10 %. (C) Trois répliques biologiques des populations de vers ont été estimées après chacun des deux transferts entre les plaques tous les 4 h. Ce transfert d’animaux entre les plaques n’a pas entraîné de diminution significative de la taille de la population. Cela indique que la méthodologie présentée ici pour les vers en mouvement n’entraîne pas une perte significative d’animaux. (D) Mesures de la population prises le long de trois répliques expérimentales EV: Le nombre d’animaux qui ont été estimés pour les larves originales de L1 qui ont commencé l’expérience, le nombre de jeunes animaux adultes récupérés dans le flotteur de saccharose et prêt pour la période d’incubation de 24 h, le nombre d’animaux comptés de la préparation EV lors de la récupération du sécréome. Il y a une diminution faible mais non significative de la taille de la population entre l’estimation initiale de la population au stade larvaire de L1 et plus tard lorsque les animaux sont de jeunes adultes. La mesure moyenne de la population de L1 a été désignée à 100 % et toutes les autres mesures ont été réduites par leur relation à cette valeur. Erreurs barres S.E.M. – valeur p ‘lt; 0.05, N.S. ‘ pas significatif dans un t-test paramétrique apparié. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Le rapport protéines-animaux est une mesure utile pour caractériser une préparation de EV. Cette mesure peut fournir un moyen rapide de déterminer la cohérence entre les préparations EV. En moyenne, 1 000 jeunes animaux adultes de type sauvage sécrèteront 1 g de protéines de plus de 10 kDa dans leur environnement(figure 4A). Lorsque cette fraction est encore séparée par la chromatographie d’exclusion de taille, le profil total d’elution de protéine montre un petit pic de protéine entre 2-6 mL et un grand pic après 8 mL. Les véhicules électriques sont contenus dans les 5 premiers ml de la colonne eluate (figure 4B). L’analyse de suivi des nanoparticules, les 5 premiers ml de l’eluate de colonne, contient une population monodispersée de petits véhicules électriques de 150 nm(figure 4C). La microscopie électronique de transmission des fractions d’exclusion de taille révèle des véhicules électriques abondants dans la fraction d’eluate de 2 à 6 ml, mais pas dans les volumes d’élégate ultérieurs. Les véhicules électriques sont connus pour leur forme de tasse et sont donc faciles à distinguer des particules solides qui apparaissent comme des points lumineux piquants lorsqu’ils sont préparés dans des conditions de coloration négatives(figure 4D). Figure 4 : Purification des véhicules électriques C. elegans à partir de la biomasse totale sécrétée. (A) Le rapport des protéines totales de plus de 10 kDa au nombre de vers incubés dans la préparation de 10 répliques biologiques a été tracé. La plupart des préparations contenaient 1 g de protéines pour 1 000 animaux. (B) Profil d’elution des protéines d’une colonne de résine de 10 ml chargée de 1 ml de sécréome concentré. Les fractions qui sont consolidées dans d’autres analyses sont ombragées en groupes. (C) Analyse de suivi des nanoparticules de la résine consolidée des fractions d’elfes de 2 à 6 ml. L’intervalle de confiance de 95% est gris ombragé. (D) analyse TEM des fractions d’exutation consolidées de résine. Le matériau de départ avait à la fois des particules de vesicule et des particules non vésicules. La fraction consolidée d’elution de 2 à 6 ml a été enrichie pour les vésicules avec peu de particules non vésicules. Les fractions consolidées de 7 à 11 ml contenaient peu de particules ressemblant à des vésicules, mais de nombreuses particules non vésicle. Les fractions d’elution de 12 à 15 mL ne contenaient que des particules non vésicules. Toutes les micrographies sont montrées au même grossissement. Barre d’échelle 200 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Pour comparer directement les caractéristiques de cytométrie d’écoulement entre C. elegans et les véhicules électriques humains, nous avons purifié les véhicules électriques des médias conditionnés des cultures cellulaires des neurones humains avec cette méthode. La cytométrie des débits sépare les particules à partir de la diffusion de la lumière. La diffusion de la lumière à petit angle (SALS) est en corrélation avec la taille, et la diffusion de la lumière à long angle (LALS) est corrélée avec la structure interne de la membrane. La majorité des échantillons de culture cellulaire et de préparations C. elegans EV sont étroitement concentrés dans un cluster centré autour de 103 SALS et 104 LALS(figure 5A). Un histogramme d’échantillons de C. elegans EV triés par SALS montre que toutes les préparations culminent à 103 (figure 5B). Figure 5 : Les véhicules électriques C. elegans sont clairement définis par leurs propriétés de diffusion de la lumière. (A) Histogram of SALS events in three biological replicates of C. elegans EVs. 80 % des échantillons totaux sont contenus dans une population serrée et clairement définie. Semblable à l’analyse de suivi des nanoparticules, il montre que la distribution de taille des véhicules électriques C. elegans est monodisperse. L’histogramme du tampon S Basal utilisé pour diluer les échantillons est montré à titre de comparaison. (B) Comparaison des propriétés réfractives de C. elegans et de la culture cellulaire humaine EVs purifié avec les méthodes décrites dans ce texte. Les deux types de véhicules électriques présentent constamment des distributions comparables de diffusion de la lumière à angle court et long (SALS et LALS). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Le DI-8-ANEPPS étiquette solidement les véhicules électriques C. elegans, mettant constamment en évidence la majorité des événements totaux dans les échantillons dérivés de la culture C. elegans et cellulaire. Les perles et les contrôles d’étalonnage sont présentés dans la figure 6A. Les parcelles de dispersion FACS individuelles sont représentées à partir d’un échantillon de C. elegans préparé à partir de 200 000 animaux (#1) et deux préparés à partir de 500 000 animaux(figure 6B). Des véhicules électriques de 100 ml (#1) ou de 200 ml (#2,3) de culture cellulaire ont également été analysés(figure 6C). Les échantillons dérivés de C. elegans et de culture cellulaire ont montré des événements fluorescents abondants qui ont disparu lorsqu’ils ont été traités avec 0,05% De Triton-X 100 et une sonication légère. Ceci démontre que les événements étiquetés sont des structures phospholipid labiles détergentes (vésicules) plutôt que des agrégats de lipoprotéines solides insensibles au détergent. L’abondance de EV est calculée comme la différence entre le nombre d’événements dans la porte DI-8-ANEPPSMD entre les fractions sans détergent (-) et avec le détergent () moins les événements dans le contrôle de teinture seulement. Pour plus de clarté, les données présentées individuellement dans la figure 6B et la figure 6C sont résumées sous forme de graphiques à barres de la figure 6D et de la figure 6E. L’abondance des véhicules électriques purifiés n’était pas significativement différente entre les C. elegans et les préparations dérivées de la culture cellulaire(figure 6F). Figure 6 : Exemples de données sur la cytométrie des débits utilisées pour calculer l’abondance des véhicules électriques. (A) Pour s’assurer que le nombre d’événements peut être comparé directement entre les échantillons, les contrôles Buffer Only et Buffer et Dye Only doivent être exécutés au même débit et au même temps de collecte que les fractions de l’échantillon EV. Il y a très peu d’événements dans la porte DI-8-ANEPPS. (B) Résultats représentatifs du protocole di-8-ANEPPS et de traitement des détergents de C. elegans. Trois répliques biologiques sont montrées. La reproduction biologique #1 a été préparée à partir de 200 000 animaux tandis que #2 et #3 ont été préparés à partir de 500 000 animaux. La disparition des véhicules électriques avec le traitement du détergent est claire dans tous les cas. (C) Résultats représentatifs du protocole di-8-ANEPPS et de traitement des détergents utilisant la culture cellulaire humaine conditionné les médias. Les répliques biologiques #1 et #2 ont été préparées à partir de 200 ml de supports conditionnés tandis que la reproduction biologique #3 a été préparée à partir de 100 ml. (D) Graphique à barres des données recueillies à partir des trois répliques biologiques des véhicules électriques C. elegans. Barres d’erreur – S.E.M. Jumelé deux-queues t-tests entre les traitements. la valeur p et lt; 0,001. (E) Graphique à barres des données recueillies à partir des trois répliques biologiques de la culture cellulaire dérivée des véhicules électriques. T-tests à deux queues jumelés entre les traitements. la valeur p ‘lt; 0.001 (F) Le nombre d’événements sensibles au détergent étiquetés par L a été calculé pour toutes les répliques biologiques de C. elegans et de la culture cellulaire. Les valeurs entre les deux sources d’échantillons EV ne sont pas significativement différentes. T-tests à deux queues jumelés entre la valeur p des traitements et 0,685. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Le tableau 1 contient les valeurs expérimentales brutes pour la totalité de 4,5 l de chaque type d’échantillon analysé. Le nombre total d’événements prélevés sur les fractions EV purifiées auprès de 500 000 animaux était de 10 à 20x par-dessus le nombre de particules recueillies par mémoire tampon seulement, tandis que la fraction purifiée à partir de 200 000 animaux contenait environ 2x autant d’événements que la seule mémoire tampon. Le nombre d’événements dans la porte DI-8-ANEPPSMD est également indiqué pour chaque échantillon. Ces mesures peuvent être importées dans une feuille de calcul pour calculer le nombre de véhicules électriques sensibles au colorant, sensibles au détergent, tel que décrit ci-dessus. Par exemple, le nombre de véhicules électriques dans 1 ml de la première réplique biologique de C. elegans montré serait calculé comme ceci : (18 974 – 3 853 – 1 487) x (10/4,5) x 1 000 à 30 297 778. Tableau 1 : Données de cytométrie de débit tabulées. Les données présentées dans la figure 6 sont présentées sous forme de feuille de calcul. Pour chaque échantillon, l’ensemble des événements et les événements fermés DI-8-ANEPPSMD sont présentés. Chaque réplique biologique est disposée dans l’ordre des échantillons #1-3 dans le protocole. Ces mesures révèlent que le nombre total d’événements prélevés sur les échantillons de C. elegans préparés à partir de 500 000 animaux ou 200 ml de milieux conditionnés par la culture cellulaire était de 10 à 20x sur le nombre de particules prélevées par mémoire tampon seulement, tandis que la réplique biologique purifiée à partir de 200 000 animaux contenaient environ 2x autant d’événements totaux que la seule mémoire tampon. Le nombre d’événements dans la porte DI-8-ANEPPSMD est également indiqué pour chaque échantillon. Ces mesures peuvent être exportées vers une feuille de calcul pour calculer le nombre total de véhicules électriques. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).

Discussion

Un défi fondamental du champ EV est de séparer la grande variété de sous-types EV2. Les méthodes décrites ici utilisent la filtration, la centrifugation différentielle et la chromatographie de taille-exclusion pour générer une population pure de petits véhicules électriques parce que 100 nm EV ont été précédemment montrés pour être sécrétés dans l’environnement externe et fonctionnent dans les voies de communication physiologiquement pertinentes16. Les véhicules électriques purifiés par la chromatographie de taille-exclusion peuvent encore être un mélange d’exosomes et de petites microvess parce que ces sous-classes EV sont de taille similaire. Les sous-classes vertébrées EV sont généralement séparées par immunoprécipitation parce que cette méthode isole les véhicules électriques par liaison aux marqueurs sélectifs de protéines membranaires. Les méthodes décrites facilitent l’identification des protéines de marqueur de membrane de C. elegans EV. Par conséquent, à l’avenir, il pourrait être possible de séparer davantage les petites sous-classes EV par des méthodes d’immunoprécipitation analogues. En théorie, l’immunoprécipitation pourrait isoler les véhicules électriques des vers bien nourris parce que les véhicules électriques à E. coli ne devraient pas interagir avec l’anticorps. Les chercheurs intéressés à identifier les protéines et les cargaisons génétiques des sous-classes EV plus grandes peuvent le faire en sautant l’étape de filtration de 0,22 m, puis en analysant la granule plutôt que le supernatant. La découverte des abondances de protéines et de cargaisons génétiques des grands véhicules électriques permettra d’établir une compréhension plus complète des processus physiologiques qui fonctionnent à travers le sécréome C. elegans. En plus d’être sécrétés dans l’environnement, les véhicules électriques C. elegans sont transférés à l’interne entre les tissus. Par conséquent, ces méthodes n’isolent qu’un sous-ensemble de véhicules électriques C. elegans totaux. Cependant, la découverte de fret de véhicules électriques internes n’est pas possible parce qu’il n’existe aucune méthode pour séparer les véhicules électriques des vers lysed. L’analyse de cargaison de ce sous-ensemble EV sécrété à l’extérieur fournit un moyen d’identifier les marqueurs de protéines EV générales potentiels capables d’étiqueter les véhicules électriques internes.

L’ampleur de la préparation des véhicules électriques dépendra des exigences de l’expérience. Au total, 500 000 jeunes adultes fournissent suffisamment de véhicules électriques pour effectuer la cytométrie des débits, LC-MS-MS et l’analyse RNAseq en parallèle. Ce nombre peut être augmenté ou en baisse en fonction des besoins expérimentaux. Le facteur pratique le plus important pour l’échelle est le nombre de plaques de croissance de 10 cm de haut requises. Les plaques de haute croissance préparées avec 500 L de 20x concentré du jour au lendemain na22 culture soutiendra une population de 50.000 adultes de l’étape larvaire L1 jusqu’au premier jour de l’âge adulte. Par conséquent, pour mener une expérience avec 500 000 adultes, 13 plaques de forte croissance sont nécessaires : une plaque pour générer la population de L1, deux plaques pour générer les adultes pour le blanchiment, et 10 plaques pour la croissance des animaux expérimentaux. Ces mesures dépendent des conditions d’ensemencement et de croissance bactérienne des plaques à forte croissance. Par conséquent, il est recommandé de faire toutes les plaques d’une manière standardisée, puis de calibrer avec des quantités connues d’animaux.

Les vers sont comptés à deux étapes du processus de culture : 1) avant d’ensemencer les vers dans les assiettes et 2) avant de générer les supports conditionnés. La densité de culture animale a été montrée pour avoir un impact sur le comportement, le développement, et les réponses de stress15,16,17,18 et peut, par conséquent, également influencer les cargaisons ev. Par conséquent, pour une densité de culture constante, il est nécessaire d’estimer avec précision les populations de vers. Quantifier le nombre de vers en neuf gouttes donne une confiance statistique des estimations démographiques. Il est essentiel de traiter chaque goutte individuellement, en vortexant entre chaque goutte et en insérant la pipette de la même distance dans la suspension du ver. En prenant ces précautions, les valeurs de S.E.M. seront de 5 à 10 % de la population totale. Si le S.E.M. pour une population de ver est supérieur à 20%, alors quelque chose a mal tourné.

Après la période d’incubation sans bactéries de 24 h, les jeunes, de type sauvage C. elegans ramper immédiatement après l’ajout à une pelouse bactérienne. Cela indique que l’incubation n’a pas d’impact grave sur leur santé. Cependant, cette étape influence la physiologie des animaux et peut donc influencer la composition des cargaisons ev EV. Par conséquent, lorsque vous travaillez avec des génotypes très malades ou des animaux plus âgés, il est essentiel de vérifier la viabilité après l’étape d’incubation. Si tous les animaux ne survivent pas à l’incubation, augmentez la taille de la population expérimentale et diminuez le temps d’incubation. Lorsque vous travaillez avec de grands volumes de supports conditionnés, il est plus pratique d’utiliser un concentrateur de cellules agitées avec un filtre en nitrocellulose régénérée. Les véhicules électriques ne se lient pas à cette chimie de filtre aussi fortement que d’autres types de filtre14.

Le rapport de la protéine totale récupérée dans les médias conditionnés au nombre d’animaux incubés pour faire la préparation est une mesure utile. Si ce ratio est beaucoup plus élevé que prévu, il est possible que les estimations de la population aient été éteintes ou que les animaux soient morts et se sont détériorés dans les médias conditionnés. Si ce rapport est beaucoup plus faible que prévu, alors certaines protéines peuvent avoir été perdues sur les filtres pendant le processus de concentration. Bien que les méthodes FACS quantifient directement les véhicules électriques dans la préparation, cette mesure est utile parce qu’elle peut mettre en évidence les anomalies de l’échantillon au début du processus. Une autre méthode utile pour vérifier la qualité de la préparation evv est la microscopie électronique de transmission, comme le montre la figure 4D. Bien que le protocole pour la microscopie électronique de transmission ne soit pas formellement inclus dans cet article de méthodes en raison de la longueur, il peut être mené par des méthodes standard. Il est recommandé d’effectuer ce type d’analyse, du moins au début, comme méthode complémentaire au FACS pour évaluer la qualité des préparations EV. Pour de meilleurs résultats, utilisez des grilles de captage-carbone fraîchement déchargées et colorez les échantillons avec 2 % d’acide phosphotungstique au lieu de l’acétate d’uranyl.

DI-8-ANEPPS a été choisi parce qu’il a été montré pour étiqueter quantitativement les membranes EV, surpassant d’autres colorants EV généraux avec des échantillons de biopsie humaine et des liposomes25. Les mesures sont rapides, ne prenant que 3 minutes de temps de collecte pour chaque échantillon. La quantification des véhicules électriques sensibles aux détergents a une signification fonctionnelle directe parce qu’elle capitalise sur une distinction physique fondamentale entre les véhicules électriques et les agrégats de lipoprotéines solides. Fait important, cette méthode n’est pas influencée par la quantité totale de protéines ou de nombre d’agrégats non-EV et peut donc quantifier les véhicules électriques obtenus par différentes méthodes de purification d’une manière impartiale. La mesure EV vérifiée par le FACS que nous décrivons ici serait particulièrement utile pour les études qui démontrent les impacts physiologiques des véhicules électriques purifiés. Il pourrait également bénéficier au domaine ev en général d’établir une méthodologie FACS comme mesure universelle afin que les abondances absolues de VE puissent être directement comparées à toutes les études. Les colorants vitaux peuvent également étiqueter les véhicules électriques C. elegans, mais ils ne sont pas aussi brillants que les véhicules électriques étiquetés avec Di-8-ANEPPS.

Cette approche de purification capitalise sur la sécrétion active des véhicules électriques à l’extérieur des corps de vers vivants intacts. Cela permet aux véhicules électriques C. elegans d’être isolés à une pureté et une abondance comparables à partir de la culture cellulaire, des spécifications qui sont suffisantes pour identifier des centaines de protéines et d’ARN cargos via LC-MS-MS et RNAseq analyse26. Ainsi, la grande bibliothèque de réactifs disponibles pour la recherche C. elegans peut être exploitée pour étudier l’influence de la perturbation génétique et physiologique sur la composition de la cargaison EV.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Nick Terzopoulos pour les plaques de ver et les réactifs; le Caenorhabditis Genetics Center (CGC) du Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440) pour la ligne de nématodeS N2; Lucia Vojtech, Ph.D., pour l’aide à l’analyse de suivi des nanoparticules; Jessica Young, PhD, et Marie Claire, MD, PhD, pour les médias cellulaires neuroalcés dérivés du hiPSC; Wai Pang pour l’aide avec l’imagerie TEM. Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH P30AG013280 à MK et les NIH accordent AG054098 à JCR.

Materials

0.22 filters units Genesee 25-233 For clairifying the conditioned media from debris
1% solution of Triton X-100 ThermoFisher HFH10 Add this to 0.05 % to lyse EVs
10 cm high growth plates N/A N/A For cultivating large populations of worms
2-liter bottom baffled flasks ThermoFisher 4110-2000PK For conducting size exclusion separation of EVs
40 μm mesh Amazon CMY-0040-C/5PK-05 Use this to separate adult worms from larval stages
5 μm mesh Amazon CMN-0005-C Use this to separate L1s from other worm stages
6 cm normal growth medium worm cultivation plate N/A N/A For cultivating small populations of worms
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C7715 For concentrating the size exclusion elute
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C78144 For concentrating the conditioned media
Apogee A50 flow cytometer Apogee This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles
ApogeeMix Apogee 1493 Assess light scatter and fluorescence performance of FACS
DI-8-ANEPPS ThermoFisher D3167 Add this at 20 uM to label EVs
Disposable chromatography Column BioRad 7321010 For conducting size exclusion separation of EVs
Geletin MilliporeSigma G9391-100G To treat pipette tips so that worms do not stick
HALT protease inhibitor ThermoFisher 87785 Add to EV sample to prevent protein degradation
Low-protein binding collection tubes ThermoFisher 90410 Use these for EV samples
NaCl Sigma S7653-1KG For sucrose floatation of worms
S Basal buffer N/A N/A Recipe in WormBook
Sepharose CL-2B resin MilliporeSigma CL2B300-100ML For conducting size exclusion separation of EVs
Small orbital shaker ABC Scientific 83211301 Use this for worm S Basal incubation
Sucrose Sigma S8501-5KG For sucrose floatation of worms
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Referencias

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Russell, J. C., Postupna, N., Golubeva, A., Keene, C. D., Kaeberlein, M. Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (157), e60596, doi:10.3791/60596 (2020).
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