卡诺尔哈布炎细胞外囊泡的纯化与分析

1. 准备 将 2 克明胶加入 100 mL 的 dH2O，并在微波炉中加热，直到开始沸腾。然后搅拌，让它冷却20分钟。 通过 0.22 μm 过滤器将溶液送至无菌管中。在使用前立即使用明胶处理移液器提示，通过移液和排出明胶溶液。处理后的小窍门可以立即使用或存储。 从无菌盖过滤器中切出膜。 湿20厘米平方的5μm尼龙网织物，并放置在无菌帽过滤器的顶部。用几个厚的橡皮筋固定它。注意：仔细检查织物，确保没有褶皱。这些使空气间隙阻碍吸力。 2. 计算大量蠕虫（图1A） 涡流和移液器 10 μL 的蠕虫悬浮液悬浮到蠕虫培养板盖或玻璃滑道上。重复此过程 3 倍。记录每次掉落的动物数量。 将蠕虫悬浮液调整到每 μL 两只动物。 在滑道或板盖上涡旋悬架和移液器九滴 （10 μL）。手动计算动物数量。记录每次掉落的动物数量。 计算平均值 （S.E.M.） 的平均值和标准误差，作为每个蠕虫群的百分比。 计算每个种群的动物总数，将平均值除以10 μL，然后乘以蠕虫悬浮在μL中的总体积。 图 1：用于生成、量化和纯化C. elegans EV 的过程概述。（A） 计算大量动物的示意图。（B） 用于收集电动汽车的蠕虫的示意图。（C） 净化EUV的原理图。请点击此处查看此图形的较大版本。 3. 培养用于EV净化的C.elegan 产生大量开发同步的C.elegans。为此，请按照以下步骤操作。 在6厘米的正常生长介质板上加入一只动物。孵育两代人，然后将动物洗到两个高生长的中等板上。 孵化，直到蠕虫耗尽食物。 在步骤 1.4 中制备 5 μm 尼龙网的过滤 L1 蠕虫。将螺杆盖放在无菌瓶上，启动真空，并将蠕虫倒在过滤器上。将介质的相同体积传递到筛选器上的蠕虫聚合。 量化蠕虫并计算总数（参见步骤 2）。最近饿死（<24 h）蠕虫生长在高生长板上，导致约80，000L1幼虫。 离心L1幼虫在2，000 x g下3分钟。重新悬浮到每mL100，000只动物。 每块高生长板放置50，000只动物。在20°C下培育动物，直到它们成为肉汁成人（约72小时）。 通过标准方法漂白重力成人，并允许胚胎以2.5μg/mL胆固醇在10 mL的S基底溶液中孵化。 量化L1幼虫（参见步骤2），然后在每个高生长板中添加50，000个蠕虫。 在20°C下培养盘子，直到动物是年轻的成年人。 为秘密生成准备C.elegan。 在每个高生长板中加入15 mL无菌M9，加入50μg/mL卡贝尼辛，从板中清洗蠕虫。让饱和板坐5分钟。通过绕着盘子圈缓冲器来驱赶蠕虫。避免晃动。将缓冲器从每个板倒入单独的 50 mL 锥形管中。重复洗涤步骤 2 倍以上，每板共 45 mL 缓冲液。 让蠕虫沉淀15分钟，将上清液浸结，并将50 mL的新鲜M9缓冲液添加到管子中。总共重复 4 次。 浮动蠕虫在30%蔗糖阶梯梯度的顶部，并在S基萨尔溶液24恢复动物。 在15mL的冰冷100mNaCl中短暂重新悬浮蠕虫，加入15 mL的冰冷60%蔗糖，并反转混合。用玻璃移液器轻轻层 5 mL 的冰冷 100 mM NaCl 在蔗糖混合物的顶部。 在1，500 x g的离心机5分钟。蠕虫将集中在NaCl和蔗糖之间的接口。 轻轻地将动物从界面移出，放入新的50mL锥形管中。将 S 基底溶液添加到 50 mL。让蠕虫沉降 5 分钟。 去刺激上清液，并添加新鲜的50 mL的S基底溶液。至少重复 3 次。 量化步骤 2 中描述的蠕虫数量。 用含有2.5微克/mL胆固醇和50μM的卡贝尼林的无菌S基底溶液将蠕虫重新悬浮到每μL一只动物的密度。 要准备分泌剂生成样品，将多达 400 mL 的悬浮液添加到无菌 2 L 底部糊解瓶中。 将烧瓶放在圆形旋转器上，以 100 rpm 的速度在 20°C 培养箱中放置 24 小时。 4. EV 纯化 收获和分馏 从培养箱中取出2L瓶蠕虫，将动物用50mL锥形小瓶（500 x g，2分钟）中颗粒。 通过 0.22 μm 真空过滤器倒出上清液，以清除任何颗粒碎屑。注：此时，含有分泌物和囊泡的过滤上清剂可以储存在-80°C。 计算步骤 2 中描述的动物数量。 通过将一滴悬浮蠕虫放在细菌草坪上，确定蠕虫的生存能力。等待15分钟，然后评分动物为移动，瘫痪，或死亡。 使用再生的硝基纤维素10 kDa过滤单元将0.22μm过滤上清液浓缩到700μL。加入150 μL S基底溶液，然后在过滤器和涡流上加入移液器。重复 2 倍。 在4°C下将浓缩上清液在18，000 x g下离心20分钟，并将上清液转移到新管中。此步骤可清除处理过程中可能积聚的任何潜在碎屑或较大颗粒。 根据制造商的说明添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒 + EDTA。注：此时，含有分泌物和囊泡的浓缩上清液可储存在-80°C。 大小排除色谱 将 80×200 μm 阿加罗斯树脂（孔径分馏范围为 70，000 至 40，000，000 kDa 用于球状蛋白）倒入空重力流柱盒中。流 S 基底溶液，直到树脂床以 10 mL 的最终体积包装。注：如果将过多的树脂倒入柱盒中，则分散柱的顶部，然后用移液器去除多余的。 通过柱通过 40 mL 的无菌过滤 S 基底溶液，让它在重力动。注意：检查树脂是否未受到干扰。 让缓冲器流动，直到树脂顶部不浸没，然后盖住柱盒的底部。在列下方放置一个收集管。 取下放在墨盒上的盖。将步骤 2.1 中获得的浓缩分泌层按滴添加到柱床顶部。移液器 1 mL S 基底溶液下降。在柱下放置一个新鲜的收集管。 用 5 mL S 基底溶液缓慢填充上柱储液，以免干扰树脂。收集前2 mL的液化，然后快速更换管，并收集下一个4 mL。这是为电动汽车富集的分数。 用再生的硝基纤维素10 kDa分子量切断（MWCO）过滤器将液化酶浓缩到300μL，并将转位重新转移到低结合微离心管。 通过涡旋 20 s 和将缓冲液移液移过过滤器，使用 100 μL S 基底溶液清洗滤膜 2 倍。添加到初始样品中，最终体积为 500 μL。 根据制造商的说明添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒。 立即执行下游实验（RNAEeq、LC-MS-MS、GC-MS-MS、西、FACS等），或储存在-80°C。 5. EV丰度流细胞测量定量 染料制备 使用新鲜的 DMSO 制备 10 mM 的 DI-8-ANEPPS 库存。分配到10μL等号，并储存在-20°C。 通过在具有 10 μL 染料库存的管中加入 90 μL 无菌过滤 PBS，制备 1 mM 工作溶液。 实验样品制备 将 840 μL 的 S 基底溶液添加到微离心管中。然后加入第4.2节和涡旋中产生的纯化EV的60μL。 将样品的300μL报价成两个新的微离心管。现在有一套实验性的三管，每个管子含有300μL的稀释性EV。标记管#1+3。样品#2，#3加入5.1.2制备的DI-8-ANEPPS库存的7μL。然后加入7 μL的1%Triton-X 100到管#3。通过涡旋混合每个管。 通过将声波器尖端置于样品中间，并在 20% 功率 30% 的占空比下脉冲 10 次，从而#3声波样品。注意：确保声波器探头的尖端位于样品中间，以便将泡沫生成保持在最低水平。泡沫可能导致电动汽车聚集，从而影响样品。 将 300 μL 的 S 基底溶液添加到两个微离心管中。将步骤 5.1 中制备的 DI-8-ANNEPS 工作试剂的 7 μL 添加到第二管，并标注”仅染料”。标记另一管”仅限缓冲器”。注：仅准备染料和缓冲器仅控制样本和实验样品与相同的S基底源。 将样品从直接光和室温下孵育1小时。 进行 FACS 实验。 将 FACS 激励滤清器设置为 488 nm（蓝色），将排放滤清器设置为 605 nm（橙色）。将流速设置为 1.5 μL/分钟。 运行纳米珠 FACS 校准组合（可选但建议）。 在 FACS 机器上运行每个样品 3 分钟（180 秒）。注意以秒为单位的确切运行时间。 分析 FACS 数据。 使用 FACS 分析软件打开文件。 通过单击”轴”，从下拉菜单中选择 Y 轴切换到488-Org（区域）。 设置从绘图顶部开始的矩形门，从 SALS 级别 102到 10 4（<300 nm 大小的粒子） 跨越。4向下扩展门，直到它包含总事件的 2.5%。将门命名为”DI-8-ANEPPS+”事件。 样品EV丰度量化 复制此门并将其粘贴到实验集中的其他两个样本以及”仅缓冲区”和”仅染料”控件上。将分析导出到电子表格。 如果 FACS 样本未在建议的 3 分钟（180 s）内运行，则将样本中的所有事件计数规范化为每 180 秒的事件。例如，如果样本运行为 250 s，DI-8-ANEPPS® 事件编号将缩放为 250 s/180 s。 通过从样品#2中减去”仅染料”控件中的 DI-8-ANEPPS® 事件数来删除染料背景事件。 通过减去示例#1中的 DI-8-ANEPPS® 事件数来删除等值型背景事件。 通过减去样品#3中的 DI-8-ANEPPS® 事件数来消除对洗涤剂不敏感的事件。此值是真实 EV 的数量。 计算样品1 μL中的EV数，方法是将步骤 5.5.5 中计算的值除以 μL 分析的体积（如步骤 5.3 中所述，4.5 μL 分析），再乘以稀释系数（步骤 2.5 中所述的 10 倍）。将此值乘以 EV 制备中剩余 μL 的数量。这是可用于下游分析的 EV 数量。 图2：流式细胞测定样品制备原理图，量化EV丰度。（A） EV 制备分为三个相同的样本。样本 # 1 是无染料负控件。然后，DI-8-ANEPPS 被添加到样品#2和#3。然后，Triton-X 100 将添加到示例#3。绿色箭头表示只有样品#3随后声波。来自流量的数据有助于确定 FACS 样品中洗涤剂敏感 EV 的绝对数量，然后计算总制备中电动汽车的丰度。确定染料阳性事件的大门设置与样品#1，其中不包含染料。电子表格数据上的红色书写是为了说明从洗涤剂处理的样品中减去染料阳性事件。（B） 用于量化 FACS 中 EV 的方程分析了样本并计算样本中 EV 的总数。请点击此处查看此图形的较大版本。