כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.
Abstract
אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לחקור ביטוי חלבונים ולוקליזציה במהלך מצבי התפתחות נורמלית ומחלות. למרות שפרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה רבים הוטלו לצורך מקטעי רקמות ורקמות, פרוטוקולים אלה דורשים לעתים קרובות שינוי ואופטימיזציה עבור אורגניזמים מודל שאינם יונקים. מערכת זברפיש משמשת יותר ויותר כמערכת מודל במחקר בסיסי, ביולוגי וטרנסלזמי לחקירת מנגנוני ההתפתחות המולקולריים, הגנטיים והסלולאריים של התהליכים ההתפתחותיים. Zebrafish מציעים יתרונות רבים כמערכת מודל, אבל גם דורשים טכניקות שונות עבור זיהוי חלבון אופטימלי. כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו לגבי. פרוטוקול זה מתאר בנוסף כמה אסטרטגיות הרכבה שונות שניתן ליישם וסקירה של היתרונות והחסרונות שכל האסטרטגיה מספקת. כמו כן, אנו מתארים שינויים בפרוטוקול זה כדי לאפשר זיהוי של מצעים כרומוגניים ברקמות הר שלמות וזיהוי של קרינה ברקמת זחל מנות. פרוטוקול זה חל באופן כללי על חקר שלבים ומבנים עובריים רבים.
Introduction
הדגים (danio rerio) התפתחה כמודל רב עוצמה לחקר תהליכים ביולוגיים מכמה סיבות כולל זמן הדור הקצר, התפתחות מהירה, ואת היכולת הגנטית לטכניקות גנטיות. כתוצאה מכך, הדגים משמשים בדרך כלל בתפוקה גבוהה של מולקולת מולקולה קטנה עבור מחקר הרעילות וגילוי הסמים. Zebrafish הם גם מודל אטרקטיבי למחקר של תהליכים התפתחותיים בהתחשב כי נקבה אחת יכולה לייצר באופן שגרתי 50-300 ביצים בכל פעם, העוברים ברורים באופן ברור לפתח באופן חיצוני המאפשר הדמיה יעילה של תהליכים התפתחותיים. עם זאת, מחקר מוקדם הסתמך בעיקר על מסכי גנטיות קדימה באמצעות N-אתיל-N-הניטרוסוראה (אנו) או אחרים מוטגנים בשל אתגרים בהקמת טכניקות גנטיות הפוכה. בערך לפני שני עשורים, שורגוולנוס. השתמשו לראשונה ב-“דג” כדי להוריד גנים ממוקדים1 מורגוולנוס הם מיעוט אנטי-היגיון קטן, העכב את התרגום של mRNA המטרה לאחר ההזרקה לעובר בשלב התפתחותי מוקדם. החולשה העיקרית של מורגוולנוס היא שהם מדולל כמו תאים הפער בדרך כלל לאבד את היעילות על ידי 72 שעות לאחר הפריה (hpf). בעוד מורגוולנוס להישאר כלי רב עוצמה עבור דג זברה גנים שיבוש, שעתוק activator כמו אפקטור נוקלאוסיס (talens), אבץ-האצבעות הנוקלאוטיות (zfns), ו מקובצים באופן קבוע במרווחים קבועים palin,הגנוםהקצר (crisprs) הם יותר לאחרונה בשימוש ישירות המטרה הגנטית zebra אלה אסטרטגיות גנטיות הפוכה, בשילוב עם גנטיקה קדימה מסכי תפוקה גבוהה, הקימו את דג זברה כמודל רב עוצמה כדי ללמוד ביטוי גנים ותפקוד.
היכולת ללמוד את פונקציית הגנים דורשת בדרך כלל הערכה של התפלגות הזמן הזמני של גנים או ביטוי מוצר גנטי. שתי הטכניקות הנפוצות ביותר כדי להמחיש דפוסי ביטוי כאלה במהלך ההתפתחות המוקדמת נמצאים היברידיזציה באתרו (ISH) ואת כל הר אימונוהיסטוכימיה (IHC). באתר היברידיזציה פותחה לראשונה בשנת 1969 ומסתמך על השימוש בבדיקות אנטי-RNA המותווית נגד היגיון כדי לזהות ביטוי mRNA באורגניזם4. לעומת זאת, נוגדנים המסומנים בתווית משמשים ב אימונוהיסטוכימיה כדי להמחיש את הביטוי חלבון. הרעיון של תיוג חלבונים לאיתור תאריכיםשל שנות ה -30 ו- ihc הראשון הניסוי פורסם בשנת 1941 כאשר נוגדנים fitc התווית שימשו כדי לזהות חיידקים פתוגניים ברקמות הנגועות6. ISH ו-ihc התפתחו והשתפרו באופן משמעותי במהלך העשורים הבאים וכעת הן בשימוש שגרתי במעבדת המחקר המולקולרית והאבחוני7,8,9,10,11. בעוד שתי טכניקות יש יתרונות וחסרונות, IHC מציע מספר יתרונות על ISH. למעשה, IHC הוא הרבה פחות זמן רב מאשר ISH והוא בדרך כלל פחות יקר בהתאם לעלות של הנוגדן העיקרי. בנוסף, ביטוי mRNA אינו תמיד ממדד אמין של חלבון ביטוי כפי שהוא הוכח עכברים ואנשים שרק על שליש של וריאציה שפע של חלבון ניתן להסביר על ידי mRNA שפע12. מסיבה זו, IHC היא תוספת חשובה לאישור נתוני ISH, כאשר הדבר אפשרי. לבסוף, ihc יכולים לספק נתוני התאמה לשפות משנה ולוקליזציה משותפים שאינם ניתנים לקביעה על-ידי ISH13,14,15. כאן, אנו מתארים שיטה צעד אחר צעד כדי לזהות באופן מהימן חלבונים על ידי אימונוהיסטוכימיה בכל העוברים הר דג זברה וזחלים. המטרה של טכניקה זו היא לקבוע את הביטוי המרחבי והזמני של חלבון מעניין בעובר כולו. טכנולוגיה זו משתמשת אנטיגן העיקרי נוגדנים ומתויג באמצעות נוגדנים משניים מסומנים. הפרוטוקול הוא להתאמה בקלות לשימוש על מקטעים רקמה רכוב שקופיות לשימוש עם מצעים כרומוגניים במקום של זריחה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מדגימים כי פיתוח שריר השלד דג זברה מבטא קולטני גלוטמט ביונוספטרופי, בנוסף קולטני אצטילכולין. NMDA-type גלוטמט לקולטן תת יחידות לזיהוי על שריר האורך ב -23 hpf.
Protocol
Representative Results
Discussion
אימונוהיסטוכימיה הוא כלי רב-תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את הביטוי הזמני-מיותר של חלבון כמעט כל עניין של אורגניזם. אימונוהיסטוכימיה משמש על מגוון רחב של רקמות ואורגניזמים מודל. פרוטוקול זה הותאם במיוחד לשימוש ב-zebrafish. אימונוהיסטוכימיה במינים שונים עשויים לדרוש קיבוע שונים וטכניקות ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון מ-NIH גרנט 8P20GM103436 14.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
Referencias
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neurociencias. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all–a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
