Evaluering av T Follikulære hjelperceller og germinal senterrespons under influensa A-virusinfeksjon hos mus

I det siste tiåret har mange studier vært fokusert på den nylig identifiserte CD4⁺ T celleundersett, Tfh celle undergruppe, for sine viktige roller i germinal center (GC) B utvikling. B cellelymfom 6 (Bcl6), som hovedsakelig betraktes som en genrepressor, er den lineagedefinerende faktoren til Tfh-celler for bevis på at ektopisk uttrykk for Bcl6 er tilstrekkelig til å drive Tfh differensiering mens mangel på Bcl6 resulterer i forsvunnet Tfh differensiering^1,2,3. I motsetning til andre CD4⁺ T hjelper undergrupper som utfører sin effektorfunksjon ved migrering til betennelsesstedene, gir Tfh-celler B-cellehjelp hovedsakelig i B-cellefollikelsonen av milt og lymfeknute. Samtidige molekyler ICOS og CD40L, spiller betydelige roller i samspillet mellom Tfh og GC B-celler. Under Tfh differensiering overfører ICOS nødvendige signaler fra kognate B-celler og fungerer også som en reseptor som mottar migrasjonssignaler fra tilskuer B-celler for B-cellesone^{lokalisering 4,5}. CD40L er en mediator av signaler fra Tfh celler for B-celler spredning og overlevelse⁶. En annen faktor som spiller lignende rolle som CD40L er cytokin IL21, som hovedsakelig utskilles av Tfh-celler. IL21 regulerer direkte GC B celler utvikling og produksjon av høy affinitet antistoffer, men dens rolle i Tfh differensiering er fortsatt kontroversiell^7,8. PD-1 og CXCR5, som nå brukes oftest i å identifisere Tfh-celler i flytcytometrianalyse, spiller også betydelige roller i differensieringen og funksjonen til dette delsettet. CXCR5 er reseptoren for B celle follikulær chemokin og medierer lokalisering av Tfh celler i B cellesekkene⁹. PD-1 er nå identifisert for ikke bare å ha follikulær veiledningsfunksjon, men overfører også kritiske signaler i prosessen med GC B-cellers affinitet modning¹⁰. Basert på disse funnene kan evaluering av uttrykket av disse molekylene i utgangspunktet gjenspeile modningen og funksjonen til Tfh-celler.

GC er en indusert forbigående mikroanatomiisk struktur i sekundære lymfoide organer og svært avhengig av Tfh-celler, og dermed være en perfekt avlesning for å evaluere Tfh-respons. I GC, etter å ha mottatt signaler mediert av cytokiner og samtidig stimulerende molekyler, er B-celler gjenstand for klasseveksling og somatisk hypermutasjon for å generere høyaffinitetsantistoffer¹¹. Differensial antistoff klasseveksling skjer i differensial cytokin nisje, der IL4 og IL21 indusere IgG1 klasse bytte mens IFNγ induserer IgG2 klasse bytte¹². Plasmaceller er produsenter av utskillede antistoffer og er terminalt differensierte celler. Som Tfh-celler er utvikling av B-celler i GC forbundet med dynamisk uttrykk for mange betydelige molekyler. Basert på den nåværende studien kan GC B-celler identifiseres som B220⁺PNA⁺Fas⁺ eller B220⁺GL7⁺Fas + celler^og plasmaceller, sammenlignet med deres forløpere, nedregulere uttrykk for B220 og overgulere CD138 uttrykk¹³. Des des, begge disse egenskapene kan oppdages i flyt cytometri og immunofluorescence analyse, og dermed være hensiktsmessig evaluering av GC respons.

Robuste cellulære og humorale responser induseres i influensavirusinfeksjon, med Tfh- og Th1-celler som dominerer CD4⁺ T-cellerespons¹⁴, noe som gjør det til en perfekt modell for Tfh-cellerdiensieringsstudie. Influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), som er en vanlig mustilpasset stamme, brukes ofte i denne studien^14,15,16. Her beskriver vi noen grunnleggende protokoller for Tfh studierelevante analyser i influensavirusinfeksjon: 1) intranasal inokulasjon av PR8-virus; 2) antigenspesifikke Tfh-celler, GC B og plasmaceller og IL21-deteksjon med strømningscytometri; 3) histologisk visualisering av GC; 4) påvisning av antigenspesifikt antistofftiter i serum med ELISA. Disse protokollene gir de nødvendige teknikkene for nye forskere i Tfh-assosiert studie.