광유전학적으로 변조된 심근세포 활동의 전기기계적 평가

모든 토끼 실험은 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 대한 유럽 의회의 지침 2010/63/EU에 명시된 지침에 따라 수행되었으며 바덴 뷔르템베르크지방 당국의 승인을 받았습니다(Regierungspräsidium Freiburg, X-16/10R, 독일). 1. 세포 분리를 위한 솔루션 하기 요건(표 1)의 물로 셀 절연용 용액을준비하고(표 1)및 표 2에열거된 이온 조성물에 따라.참고 : CaCl2 및 MgCl2는 1 M 재고 솔루션에서 추가됩니다. 물 요구 사항 25°C에서의 전도도[μS/cm] 0.055 파이로겐 [EU/mL] < 0.001 입자 (크기 > 0.22 μm) [1/mL] ≤ 1 총 유기 탄소 [ppb] < 5 미생물 [CFU/mL] ≤ 1 RNase [ng/mL] < 0.01 DNase [ng/mL] LT; 4 표 1: 물 요구 사항. 생리식염수 용액 (1) 저칼슘, 고칼륨 용액 (2) 효소 용액 (3) 차단 솔루션 나클 [mM] 137 137 137 137 KCl [mM] 4 14 14 14 헤페스 [mM] 10 10 10 10 크레아틴 [mM] 10 10 10 10 타우린 [mM] 20 20 20 20 포도당 [mM] 10 10 10 10 MgCl2 [mM] 1 1 1 1 아데노신 [mM] 5 5 5 5 L-카르니틴 [mM] 2 2 2 2 CaCl2 [mM] 1 – 0.1 0.1 나헤파린 [IU/L] 5000 – – – EGTA [mM] – 0.096 콜라게나아제 타입 2, 315 U/mg [g/L] – – 0.6 – 프로테아제 XIV [g/L] – – 0.03 – 소 세럼 알부민 [%] – – – 0.5 삼투압 [모스몰/L] 325 ± 5 345 ± 5 345 ± 5 345 ± 5 표 2: CM 격리를 위한 솔루션입니다. 모든 솔루션을 37°C에서 pH 7.4로 조정하고 삼투압을 확인합니다.참고: 심장 절삭 직전에 효소(콜라게나제 타입 2 및 프로테아제 XIV)를 직접 녹입니다. 사용하기 전에 모든 용액을 산소화하십시오. 2. 랑엔도르프 관류 설정 준비 참고: 사용된 설정은 사용자 지정설정입니다. 도 2에도시된 바와 같이, 설정은 3개의 물 자켓 처리된 저수지(1-3), 나선형 역유동 열교환기 1개(4) 및 물자켓 관류 용기(5)로 구성된다. 그림 2: 토끼 세포 격리에 최적화된 랑엔도르프 관류 설정. (1-3) (1) 생리식염수 용액, (2) 낮은 칼슘, 높은 칼륨 용액 및 (3) 효소 함유 심전염용액을 함유한 물 자켓 처리체. (4) 나선형 카운터 플로우 열 교환기 및 (5) 물 재킷 수집 탱크. 물 재킷 시스템의 유입은 나선형 열교환기 (열교환기의 끝에 관류 캐뉼라를 떠나는 용액의 온도는 37 °C에서 일정해야 함), 이어서 관류 용기 및 3 개의 저장소가 뒤따릅니다. 모든 용액은 산소화(파선)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 열교환 시스템에서 38 °C에서 물을 순환하고 모든 용액을 37 °C로 예열하기 위해 수조 펌프를 켭니다.참고: (4)의 유출 온도는 37°C에서 제어되고 일정해야 합니다. 3개의 저장소를 각각의 용액으로 채우고 각 라인(검은색)을 해당 용액으로 세척합니다. 용액(1)을 사용하여 기포 없이 끝에 있는 주(파란색) 선을 채웁니다.참고: 사용 전(10분) 및 사용 중에 용액을 산소공급하십시오. 낮은 칼슘, 높은 칼륨 용액으로 저수지 (3)에서 탭까지 라인을 채웁니다. 캐뉼라에서 대장 주위의 심장을 묶기 위해 봉합사를 준비하십시오. 3. 세포 격리 다음 주사기를 준비합니다. 용 분과/마취의 경우: 0.5 mL/kg 체중 에스케타민 염산염(25 mg/mL)과 0.2 mL/kg 체중 자일라진 염산염(2%)을 섞으세요. NaCl 용액 12 mL (0.9 %)으로 두 개의 주사기를 채웁니다. 0.9% NaCl 용액에 용해된 12.5 mg/mL 나티오펜탈 6 mL를 준비합니다. 주사기에 에스케타민 염산염 0.2 mL (25 mg / mL)을 채웁니다. 0.9% NaCl 용액의 1 mL에서 나 헤파린 (5,000 IU / mL)의 0.2 mL을 희석하십시오 (최종 농도 1,000 IU / mL). 체테테/마취 토끼 (9-10 주, 뉴질랜드 흰 토끼, 여성 또는 남성, ~2 kg) 에스케타민 염산염 및 자일라진 염산염의 근육 주사를 통해 (단계 3.1.1).참고 : 토끼는 완전히 마취되기 위해 적어도 10 분이 필요합니다. 정확한 기간은 체중에 따라 다릅니다. 오른쪽 반사의 손실로 마취를 확인합니다. 정맥이 있는 가슴과 귀를 면도하십시오. 유연한 캐뉼라를 귀 정맥에 삽입하고 테이프로 고정하고 0.9 % NaCl 용액으로 씻어 내보하십시오. Na-헤파린 용액 1 mL을 정맥 내 로 주입하고 0.9 % NaCl 용액으로 씻어 내소하십시오. 에스케타민 염산염 0.2 mL를 주입하고 0.9 % NaCl 용액으로 다시 씻어 내고 무호흡증이 될 때까지 Na-thiopental을 주입하십시오.참고 : 토끼는 페달 철수 반사에 응답하지 않아야합니다. 왼쪽 가슴을 열고 심낭을 제거합니다. 심장이 절제될 때 타이머를 시작하고 생리식염수 용액으로 심장을 두 번 씻으하십시오.참고: 심장 조직의 우발적 인 손상을 방지하기 위해 둥근 팁이있는 가위를 사용하십시오. 생리식염수 용액으로 욕조에서 대인을 수조절하고 모든 조직을 용액에 보관하십시오. 랑엔도르프 관류 시스템(생리식염수 용액(1), 속도 24 mL/min)을 켭니다. Langendorff-관류 설정에 마음을 전송, 대류를 침투 노즐에 연결하고, 단단히 캐뉼라에 대공 주위 봉합사와 마음을 묶어 (< 1 분).참고 : 생리 식염수 용액으로 캐뉼라를 미리 채우고 캐뉼기에서 랑엔도르프 설정으로 운송하는 동안 기포가 캐뉼라에 들어가지 않도록하고 거품이없는 곳에 연결하십시오. 모든 혈액이 씻겨 나갈 때까지 심장을 정성하십시오 (2-3 분). 저칼슘, 고칼륨 용액(2)으로 전환하십시오. 심장이 박동을 멈추고 효소 용액으로 전환한 후 2 분 더 퍼퓨즈하십시오. 소화 시작 후 2 분 후에 효소 용액을 다시 저수지로 재순환하십시오. 소화 5분 후 속도를 16 mL/min으로 줄이면 됩니다. 조직이 부드러워지면 (소화 40-50 분), 캐뉼라에서 심장을 잘라 내고 좌심실을 분리하십시오. 기계적 해리에 의해 세포를 방출 (부드럽게 피펫과 조직을 보유하는 미세 집게로 조직을 떨어져 당겨) 차단 용액. 메쉬(1mm2의기공 크기)와 원심분리기를 22 x g(중력 가속도)에서 2분 동안 걸러내다. 비 근세포가 함유된 상구체를 제거하고 차단 용액에서 CM을 다시 일시 중단합니다. 4. CM의 배양 참고: 멸균 조건에서 다음 단계를 수행합니다. 희석 라미닌 (엥겔브레스 – 홈 – 홈 – 스웜 뮤린 육종 지하 막에서, 1 mg / mL) 1:10 멸균 인산염 완충 식염수 (Ca2 +/ Mg2 +제외) 100 μg / mL의 최종 농도. 표 3에나타낸 바와 같이 보충제와 함께 M199-Medium에서 배양 배지를 준비한다. M199-배지에서 세포 배양 배지 크레아틴 [mM] 5 L-카르니틴 염산염 [mM] 2 타우린 [mM] 5 나 피루바트 [mM] 1 인슐린 (소 췌장) [U/L] 0.25 시토신 β-D-아라비노푸라노사이드 [mM] 0.01 겐타마이신 [mg/mL] 0.05 표 3: 세포 배양 배지. 멸균 필터 용액 (0.22 μm)을 넣고 5 % 태아 소 세럼을 추가하십시오. 패치 클램프 실험의 경우 오토클레이브 커버슬립 16mm, 두께 No. 0, 배양 전에 100 μg/mL 라미닌으로 직접 코팅합니다. 탄소 섬유 실험의 경우, 폴리 (2-하이드록세틸 메타 크릴레이트)(폴리 HEMA, 0.12 g/mL 95:5 EtOH:H20)로 페트리 접시 표면을 코팅하고 고형화시.참고 : 세포는 폴리 HEMA 코팅 페트리 접시에 ‘스틱’하지 않습니다; 이것은 세포 역학 연구 결과에 있는 그들의 마찰 없는 수축을 위해 중요합니다. CM이 다시 정지된 후(~10-15분), 상체를 제거한 다음 배양 배지에서 CM을 다시 정지시낸다. Neubauer 챔버로 CM을 계산하고 라미닌 코팅 커버슬립 또는 폴리 HEMA 코팅 페트리 접시에 17,500 셀 / mL의 목표 밀도로 종자를 계산합니다. 37°C에서 세포를 배양하고, 5%CO2를 3-4시간 동안 배양한다. 커버슬립 시드 세포의 배지(37°C)를 교환합니다. 75의 감염 (MOI)의 복합성에서 GtACR1-eGFP에 대한 아데노 바이러스 (유형 5) 코딩을 추가하고 48 시간 후에 기능적 실험을 시작합니다.참고 : 변환 후 어둠 속에서 세포를 유지합니다. 청색 또는 녹색 광 활성화 단백질로 작업할 때는 적색 조명을 사용하십시오. 시판되는 아데노바이러스 전달 시스템(재료 표참조)은 GtACR1-eGFP를 아데노바이러스 벡터내로 코딩하는 유전자를 복제하는 데 사용된다. 관심의 삽입, 여기 GtACR1-eGFP는, PCR 증폭및 인퓨전 클로닝 반응에서 CMV 프로모터를 포함하는 아데노바이러스 벡터와 결합된다. CMV(인간 사이토메갈로바이러스) 프로모터는 포유류 세포에서 형질전환의 과발현을 유도하는 데 일반적으로 사용된다. eGFP는 Aequorea 빅토리아에서 추출한 강화된 녹색 형광 단백질로 최대 488 nm, 방출 최대 507 nm입니다. 아데노바이러스(유형 5)는 샤리테 대학교, 베를린, 베를린, 마이클 슈프 교수, 베를린 주 부사조에서 외부적으로 생산되었다.주의: 아데노바이러스 전이는 BSL-2 안전 수준 작업으로 분류되며, 적절한 안전 조치가 법적으로 요구됩니다. 5. 기능 실험 참고 : 기록은 반전 형광 현미경을 사용하여 수행됩니다. GtACR1의 동시 활성화를 방지하기 위해 콘덴서의 빨간색 밴드 패스 필터(630/20 nm)로 투과광을 필터링합니다. 패치 클램프 설정 아날로그-디지털 컨버터와 함께 앰프를 사용합니다. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 전류 및 전압 데이터를 기록합니다(재료 표참조).참고: 기록된 데이터는 10kHz에서 디지털화되고 5kHz에서 필터링됩니다. 탄소 섬유 설정 카메라를 사용하여 광학 대비의 변화를 추적하여 탄소 섬유 위치와 사르코머 길이를 감지합니다(탄소 섬유는 줄무늬 셀 패턴에 중첩된 어두운 구조로 표시). 설정의 개략적 표현은 그림 3에나와 있습니다.참고: Sarcomere 길이는 줄무늬 패턴의 전력 스펙트럼의 빠른 푸리에 변환(FFT)을 사용하여 실시간으로 계산됩니다. 그림 3: 탄소 섬유 측정을 위한 실험 설정을 묘사하는 체계. (드로잉의 배율이 없습니다.) 두 개의 탄소 섬유가 세포에 부착되고 그 위치는 압전 포지셔너에 의해 제어됩니다. 페이서는 전기장 자극에 사용된다. 다색 LED는 물체 평면에서 세포의 조명을 위해 반전된 현미경의 에피플루오레전 포트내로 결합된다. LED 전원은 디지털 아날로그 컨버터(DAC)의 디지털 출력을 통해 디지털 펄스를 수신하는 전용 제어 박스를 통해 제어됩니다. DAC는 형광 시스템 인터페이스와 아날로그 출력을 통해 통신합니다. 셀룰러 이미징을 위한 흑백 카메라(774픽셀 x 245라인)가 컴퓨터에 연결되어 sarcomere 길이와 탄소 섬유 굽힘을 추적합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 시간 제 조명 서로 다른 색상의 3개의 LED(460 nm, 525 nm, 640nm, 재료 표참조)로 구성된 외부 맞춤형 LED 제어 상자를 통해 형광 현미경 검사법 및 광이온 채널의 활성화를 위한 빛을 제공합니다. 데이터 수집 소프트웨어 프로토콜에서 생성된 TTL(Time to Live) 펄스를 통해 LED를 제어할 수 있도록 제어 상자의 마이크로 컨트롤러 및 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 코드를 수정합니다(재료 표참조). 디지털 아날로그 컨버터를 통해 TTL 펄스를 LED 제어 박스로 전송합니다. LED를 구동하고 GUI를 통해 펄스 수를 선택합니다. GUI에서 명령을 받으면 마이크로 컨트롤러가 새 코어에서 프로세스를 시작합니다. 이 과정에서 TTL 입력과 GUI에서 설정된 제어 스위치가 지속적으로 확인됩니다. TTL 입력이 양수이면 마이크로 컨트롤러가 LED를 켜고 TTL 입력 확인을 다시 시작합니다. TTL 신호가 0으로 돌아오면 마이크로 컨트롤러가 LED를 끄고 남은 펄스 수를 하나씩 줄입니다. 어느 시점에서든 제어 스위치가 거짓이거나 펄스 수가 0이면 마이크로 컨트롤러는 GUI에서 새 명령을 받을 때까지 이 프로세스를 중지합니다. 직접 현미경의 백포트에 LED를 결합. 오브젝트 평면의 광도 측정 스테이지 마이크로미터(대물 배율 40배, A = 0.8mm 2)로 조명영역을측정합니다. 광학 전력 계측기(재료 표 참조)를사용합니다. 여기 파장(525nm), 객관적배율(40x), 여기 필터(530/20nm) 또는 미러와 같은 실험 설정을 정의하고 다양한 LED 입력 전압에서 광전력[W]를 판독합니다. 광력 [W]를 조명 영역 [mm 2](여기: 0.8mm2)로나누어 광강도를 계산합니다.참고: 5.6단계에서 각 프로토콜을 사용하여 실제 광전력을 측정하여 10ms 도달 및 긴 지속 시간의 짧은 광 펄스 지속 시간이 설정된 값을 유지하는지 확인합니다(보충도 1). 패치 클램프 실험 준비 다음 외부 및 내부솔루션을 준비합니다(물 요구 사항은 표 1참조). 포도당으로 삼투압을 300±5 mOsmol/L. Aliquot 내부 용액으로 조정하고 -20°C에서 보관합니다.참고: 녹화 당일에는 내부 용액을 얼음 위에 두십시오. 외부 용액을 실온에서 유지하십시오. 여기서 설명된 패치 클램프 용액은 이전에 사용된 용액및Cl-농도가 더 낮고, 더 생리학적 수준7로변경되었다. 각각의 광유전학 액추에이터의 이온 선택성의 특성화를 위해, 우리는 세포외 및 세포내용액(19)에서주요 이온(예를 들어, Cl-, Na+ ,K++ , H+)의농도를 변화시키는 것이 좋습니다. 파이펫 홀더에서 기록 전극을 벗고 매우 미세한 사포로 실버 와이어에서 은염화물 층을 제거하십시오.참고: 각 측정 일의 시작 부분에서 이 단계를 수행합니다. 와이어를 1.5V 배터리의 양극에 연결하고 10분 동안 은 염화물 코팅을 위해 3M KCl 용액에 담그면 됩니다.참고: 음극은 3M KCl 용액에 침지된 기준 실버 와이어에 연결됩니다. 측정 챔버 준비 : 측정 챔버의 프레임에 실리콘 그리스를 넣고 챔버가 밀봉 된 프레임의 상단에 커버 슬립 (직경 : 50mm, 두께 번호 0)을 놓습니다. 욕조에 참조 실버 / 염화물 펠릿 전극을 넣고 헤드 스테이지와 연결합니다. 소다 라임 유리 모세 혈관 (외부 직경 : 1.55mm, 내경 : 1.15mm)에서 마이크로 파이펫 풀러 (재료 표참조)에서 1.7 – 2.5 MΩ 패치 파이펫을 당깁니다. 데이터 수집 소프트웨어를 시작하고 멤브레인 테스트(펄스 10 mV, 15 ms, 기준선 0 mV)를 조정합니다. 외부 목욕 용액 내부 파이펫 솔루션 나클 [mM] 140 – KCl [mM] 5.4 11 CaCl2 [mM] 1 – MgCl2 [mM] 2 2 포도당 [mM] 10 – 헤페스 [mM] 10 10 K-아스파르타테 [mM] – 119 Mg-ATP [mM] – 3 EGTA [mM] – 10 Ph 7.4 (NaOH) 7.2 (KOH) 삼투압 (포도당으로 조정) [모솔/L] 300 ± 5 300 ± 5 표 4: 패치 클램프 솔루션. 패치 클램프 측정을 위한 프로토콜 -74 mV의 유지 전위에서 V 클램프 모드에서 광 활성화 프로토콜을 기록합니다. 300 ms의 광 펄스를 사용합니다.참고 : 우리는 배양 CM의 휴식 멤브레인 전위에 가까운 V 클램프 기록을 수행하는 것이 좋습니다 (I-클램프에 설립; -79 mV와 -77 mV 사이의 우리의 손에 모두 변환 및 비 변환 CM19). 갓 단리된 세포는 -79 mV의 평균 휴식 막 전위를나타낸다(보충 도 2,액체 접합 전위 보정 후 모든 값). 0 pA에서 I-클램프 모드에서 AP를 기록합니다. 전기 적 진도의 경우, 10 ms의 전류 펄스를 주입 (0 pA에서 설정 된 값에 램프 10 ms), 0.25 Hz. AP를 유도 하는 임계값을 찾을. 광학 속도 의 경우 신뢰할 수있는 AP를 유도하기 위해 최소 광 강도에서 10 ms, 0.25 Hz의 광 펄스를 사용합니다. 0 pA에서 I-클램프 모드에서 광 억제를 기록합니다. 5.6.2.1 단계에서 설명한 대로 AP를 유도하고 15개의 전기적으로 트리거된 AP 후 4mW/mm2에서 64초동안 지속된 빛을 적용합니다.참고: 그림 6F는 지속적인 빛 동안 더 높은 전류 주사가 적용되는 광 억제 프로토콜을 보여줍니다. 임계값의 1.5배(여기: 0.7 nA)부터 시작하여 주입된 전류는 0.1 nA의 단계에서 증가하였다(최종 수준: 2.2 nA). 모든 테스트 된 전류 진폭에서, 지속적인 광 응용 프로그램은 AP 생성을 억제. 제어 실험으로, 가벼운 응용 프로그램없이 64 s에 대한 전기 자극을 일시 중지합니다. 패치 클램프 실험참고: 어두운 환경에서 다음 실험을 수행합니다(파란색/녹색 광 활성화 도구에 빨간색 표시등을 사용할 수 있음). 외부 용액이 있는 측정 챔버에 셀이 있는 커버슬립을 놓고 형광CM을 선택합니다.참고: eGFP 양성 세포는 밴드 패스 여기 필터(450 nm – 490 nm), 510 nm 이색 거울 및 515 nm 롱 패스 방출 필터와 함께 파란색 LED(460 nm)를 사용하여 검출할 수 있습니다. 다른 형광 태그를 사용하는 경우 해당 LED 및 형광 필터 세트를 사용하십시오. 높은 감전 효율이 달성되면 (GtACR1 아데노바이러스로 손 >99%), 기능 적 실험 전에 eGFP 형광을 확인할 필요가 없습니다. 이렇게 하면 잠재적인 GtACR1 사전 활성화를 방지할 수 있습니다. 패치 파이펫을 내부 용액으로 채웁니다. 팁에 기포가 없는지 확인합니다. 파이펫 홀더에 파이펫을 부착하고 내부 용액에 기록 은염화물 코팅 실버 와이어를 삽입합니다. 셀 연결 구성에 도달한 후 -74 mV의 보유 잠재력을 가진 데이터 수집 소프트웨어의 전체 셀 모드로 전환합니다. 전체 세포 구성에 액세스하기 위해 음압을 부드럽게 가하여 멤브레인을 파열시킵니다. 이는 측정된 정전 용량의 즉각적인 증가로 표시됩니다. 섹션 5.6에 설명된 프로토콜을 실행합니다. 탄소 섬유 기술 탄소 섬유를 생산합니다. 외부 직경: 2.0 mm, 내경: 1.16 mm, 길이: 100mm (재료 표참조)와 같은 매개 변수와 함께 유리 모세 혈관을 사용합니다. 마이크로파이펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 동일한 길이의 두 개의 파이펫으로 당깁니다(총 테이퍼 길이 ~11 mm, 그림 5)을최종 내경 ~30 μm로 당깁니다.참고: 첫 번째 및 두 번째 풀에 사용되는 설정은 각각 85.2%(풀러의 최대 출력에 비례) 및 49.0%입니다(필라멘트의 풀러, 유형 및 나이에 따라 다릅니다). 12V, 24A의 설정을 사용하여 자체 제작 마이크로 단조로 파이펫을 최대 45°까지 구부립니다(피펫 굽힘 설정에 대한 자세한 내용은 그림 4 참조). 모세관(2)을 방향 원(5)의 빨간색 선에 정렬하고, 구부리기 부분의 길이가 방향 원의 중심(반경 4.5mm)의 중심 이후에 항상 동일하므로 모세관의 위치를 일정하게 유지합니다. 벤더(3)로 모세관의 끝을 아래로 밀어 모세관을 최대 45°(녹색 선)까지 구부리고 필라멘트(4)를 가열하여 위조하여 모세관이 벤더를 제거한 후에도 45° 각도를 포착합니다. 탄소 섬유(장 이브 르 구엔 교수가 제공)를 스테레오 현미경으로 유리 모세관의 미세한 끝에 맞춥니다. 끝에 부드러운 튜브가 있는 미세 한 집게를 사용하여 그립을 높이고 섬유를 손상시킬 위험을 줄입니다.참고 : 이러한 섬유는 섬유와 세포 사이의 접촉 면을 증가시켜접착력 (20)을향상시키는 미세 구조가 특징입니다. 탄소 섬유를 2mm 길이로 자르고 슈퍼 접착제 (시아노 아크릴레이트)를 사용하여 섬유를 모세관의 전면에 고정시다.참고: 섬유가 길수록 동일한 힘을 가하면 더 많이 구부러지어집니다. 탄소 섬유를 교정합니다. 0.05 mN/V의 감도와 0-0.5 mN의 힘 범위의 힘 변환기를 사용하여 탄소 섬유를 교정합니다(재료 표참조).참고: 이 설정은 “끌어오기” 대신 압축을 측정하기 위해 맞춤 제작되었습니다. 모세관을 탄소 섬유로 마이크로 매니퓰레이터와 압전 모터에 의해 제어되는 홀더에 부착합니다. 힘 센서와 접촉하여 섬유의 팁을 배치하지만, 어떤 힘을 생성하지 않고 10 μm (총 이동 60 μm)의 단계로 압전 모터를 이동하여 센서를 향해 측정 된 전압(E)을볼트로 판독한다.참고: 탄소 섬유의 자유 단부 끝에 힘 변환기가 닿는지 확인합니다. 이러한 측정을 세 번 반복합니다. 수식 1을 사용하여 각 압전 위치(압전 모터 단계 간의 측정된 전압의ΔΔ 차이)에 대한 힘을 계산합니다.참고: 힘 변환기의 감도는 트랜스듀서 모델에 따라 달라집니다(여기: 0.05 mN/V = 50 μN/V). 게인은 컨트롤러에서 설정할 수 있습니다. 압전 위치에 대해 힘 [μN]을 플로팅합니다. 경사는 섬유 강성 [μN/μm]에 해당합니다. CM 계약의 기록 힘.참고: 어두운 환경에서 다음 실험을 수행합니다(파란색/녹색 광 활성화 도구에 빨간색 표시등을 사용할 수 있음). 폴리 HEMA로 측정 챔버의 표면을 코팅합니다. 측정 챔버를 외부 목욕 용액으로 채우고 배양 된 세포 현탁액을 챔버에 몇 방울 떨어 뜨립니다 (단계 4.9). 탄소 섬유로 모세 혈관을 무대 미세 조작기에 부착하십시오. 짧은 녹색 광 펄스를 적용하여 수축을 유도하는 능력을 확인하여 GtACR1 발현 CM을 선택합니다. 탄소 섬유를 측정 챔버 의 표면에 거의 수평으로 정렬합니다. 첫 번째 섬유를 세포 표면으로 낮춥습니다. 두 번째 섬유를 CM의 다른 쪽 끝에 있는 첫 번째 섬유에 평행하게 부착합니다. 이상적인 정렬은 셀 축에 거의 수직입니다.참고: 셀을 바닥 면에 부드럽게 밀어 섬유를 부착합니다. 두 번째 섬유를 부착하기 전에 압력을 풀어 놓습니다. 두 번째 섬유를 부착하여 셀을 늘이지 마십시오. 두 섬유가 셀에 부착 된 후 섬유를 들어 올리면 세포가 더 이상 챔버 표면에 접촉하지 않고 마찰없이 수축 할 수 있습니다. 데이터 수집 소프트웨어(재료 표참조)에 sarcomeres를 집중하고 섬유 사이에 sarcomere 길이 추적 창(그림7A I(3))을설정합니다.참고: 생성된 FFT 전력스펙트럼(그림 7AI (2))은이상적으로 하나의 날카로운 피크를 나타내며, 이는 평균 sarcomere 길이를 나타낸다. 모서리 감지 모듈을 사용하여 섬유 굽힘을 추적합니다. 적색 및 녹색 창으로 검출 영역을 설정하고 광강도 추적의 첫 번째 미분에서 임계값(빨간색 및 녹색 수평 선)을 정의합니다(그림7A III). 0.25Hz에서 광학적으로 셀의 속도를 맞추기 시작하고(가능한 경우 더 빠른 속도) sarcomere 길이와 섬유 굽힘을 추적합니다.참고: 파이버 홀더 위치, LED 트리거 및 전기 자극 펄스는 데이터 수집 소프트웨어를 통해 제어됩니다(재료 표참조). 적어도 15개의 광학유도 수축을 기록한 후, 전지를 전기적으로 자극한다(재료 표참조). 임계값 전압의 1.5배를 적용하여 수축을 유도하고 기록할 임계값을 찾습니다. 억제 프로토콜의 경우 전기 자극을 적용하여 수축을 유도한 다음 64초의 지속적인 빛에 노출합니다(다양한 광 강도). 그림 4: 파이펫 굽힘 설정. (1) 왼쪽의 마이크로 조작기는 모세관의 위치를 제어하는 데 사용되며, 오른쪽에있는 두 번째 마이크로 조작기는 구부리는 데 사용됩니다. (2) 모세관. (3) 벤더. (4) 마이크로 포지. (5) 오리엔테이션 원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: 탄소 섬유가 있는 파이펫. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 6. 데이터 분석 패치 클램프 레코딩참고: 실험 후 액체 접합 전위전위가 기록된 모든 전압및 명령 전압을 수정합니다. 공구 접합 전위 계산기를 사용하여 데이터 수집 소프트웨어에서 액체 접합 전위를 결정합니다(표 4에명시된 패치 클램프 솔루션의 경우 21°C에서 14.4mV). 기록된/명령 전압에서 액체 접합 전위를 뺍니다. I-클램프 AP 레코딩의 경우 전기 속도와 광학 간격을 확인합니다. 사용자 지정스크립트(보충 자료)를사용하여 AP 지속 시간(APD)을 20% 및 90% 재분분극으로 계산합니다. 휴식 멤브레인 전위 및 AP 진폭을 결정합니다.참고 : Wang K. 외21에 설명 된 대로 APD를 결정하십시오 .abf 파일을로드하는 스크립트는 일반적으로 다음 링크를 통해 액세스 할 수 있습니다 : https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload. 6AP 이상에 대한 평균 APD 값입니다. V-클램프 광활성화의 경우 기준선이 0pA에 있는지 확인합니다. 기준선을 0으로 조정하지 않는 경우. -74 mV에서 300 ms 광 펄스에 의해 트리거 된 기록 된 전류를 분석합니다. 데이터를 데이터 분석 소프트웨어로 전송하고 피크 및 평균 고정 전류를 결정합니다. 탄소 섬유 실험 광학 속도 동안 수축 기록: 데이터 수집 소프트웨어에서 기록된 데이터를 로드하고 탄소 섬유 굽힘과 sarcomere 길이 변경의 기준선과 최대값을 판독합니다.참고: 안정적인 레코딩의 수축 10개에 대한 평균 값입니다. 셀 폭을 측정하고 타원형 단면을 가정하는 셀의 단면적을 계산합니다(그림7B II).주: 타원 영역에 대한 수식은 A = π·a·b(수식 2)이며 여기서 a는 중심에서 정점까지의 거리이고 b는 중심에서 공동 정점까지의 거리입니다. 이 경우 이것은 = (셀의 폭)/2 및 b =(셀의 두께)/2를 의미합니다. 니시무라 외22에 따르면 CM의 두께는 세포 폭의 1/3으로 추정될 수 있으므로 A = π· (1/2)·폭· (1/2)·두께 = π· (1/4)·폭· (1/3)·폭 = π· (1/12)·너비2. 종단 수축기 힘 (F)를 계산합니다. 종단 수축기 세포 변형 (ESD)을 계산합니다.참고 : 추가 수축 매개 변수를 분석 할 수 있습니다 : 휴식 sarcomere 길이, 피크 시간, 90 % 이완 시간, 분수 sarcomere 단축, 수축 및 이완의 최대 속도 (소프트웨어 수집 매뉴얼 참조).