결핵 분자 세균 부하 분석 (TB-MBLA)

1. 견본 준비 문화 깨끗한 벤치 또는 클래스 1 캐빈에서 작업, 15 mL 플라스틱 원심 분리 튜브로 지수 단계 Bacillus Calmette-Guérin (BCG) 배양의 1 mL aliquots를 수확. 튜브를 단단히 닫습니다.참고: 전체 5 mL 샘플을 처리하려면 5 개의 15 mL 원심 분리튜브가 필요합니다.주의: 결핵 배양시 생체 안전 캐비닛이 필요합니다. 환자 가래 시편 통풍이 잘되는 공간에서 작업하고 비강 마스크를 착용하고 시편 컵을 조심스럽게 열고 15 mL 플라스틱 원심 분리튜브에 파이펫 1 mL aliquots를 넣고 튜브를 단단히 닫습니다.참고: 파이펫 가래에 넓은 입 끝을 추천합니다. 한 쌍의 가위를 사용하여 1 mL 팁 입의 미세한 부분을 잘라서 입을 넓게 만듭니다. 2. 열 불활성화 시료 를 준비하기 전에 수조를 95 °C로 설정하십시오.참고: 95 °C 온도RNase 활동을 감소의 기회를 증가 하 고 따라서 다운 스트림 TB-MBLA에 대 한 더 많은 RNA를 보존. 샘플 튜브를 수조에 담근 홀딩 랙으로 옮김을 옮김으로 옮김. 각 샘플 튜브의 3/4가 물에 담그도록 하십시오. 95 °C에서 20 분 동안 끓인 다음 RNA 추출을 시작하기 전에 실온에서 5 분 동안 식히기 위해 튜브를 벤치로 옮김하십시오.참고: M. 결핵 간균 및 BCG의 완전한 열 불활성화는 성장을 확인하기 위해 42일 동안 37°C에서 열 불활성화 샘플 및 대조군을 배양하여 검증하였다. 600 nm (OD600)에서광학 밀도 측정은 기준선에서 찍은 다음 42 일 잠복기 동안 매주 취했습니다. 3. RNA 추출 참고: 여기에 설명된 RNA 추출 과정은 재료 표에나열된 RNA 키트를 위한 것입니다. 다른 제조 업체에 의해 다른 적합한 RNA 추출 키트를 사용할 수 있습니다. 추출 제어(EC) 추가 열 불활성화 샘플의 1 mL aliquots를 1.5 mL 튜브로 옮김. EC의 100 μL을 각 샘플내로 스파이크하고, 튜브를 닫고, 튜브를 거꾸로 3배 뒤집어 혼합한다.참고: EC는 TB-MBLA 생명 균 키트(재료의 표)와함께 제공 됩니다. 세포 침전 벤치탑 미세원심분리기를 사용하여 실온에서 10분 동안 20,000 x g의 튜브를 원심분리합니다. 50 μL의 퇴적물을 남기고 상급제에서 피펫을 벗겨내다. 950 μL의 용해 완충액으로 침전물을 상하로 파이펫팅하여 침전물을 중단하고, RNA 추출 키트(Tableof Materials)와함께 제공된 용해 매트릭스 튜브로 전체 현탁액을 전달한다. 튜브가 단단히 닫혀 있는지 확인하고 뚜껑과 튜브 측면에 라벨을 붙입니다. 세포 용해의 경우, 튜브를 3.2.2 단계에서 균질화로 옮김으로 옮김을 옮김. 6,000 rpm에서 40 s에 대한 샘플을 균질화합니다. 핵산 정제 실온에서 5분 동안 12,000 x g에서 3.3단계에서 용해액을 원심분리합니다. 신선한 1 mL 튜브를 준비하고 각 튜브에 300 μL의 클로로포름을 추가합니다. 1 mL 팁을 사용하여 용해 매트릭스를 건드리지 않고 상급자에서 조심스럽게 피펫을 피펫합니다. 상층을 5초 동안 튜브와 소용돌이를 함유한 클로로폼으로 옮기고, 3단계(상부, 중, 하부)가 명확하게 보일 때까지 튜브를 5분 이상 정착시키도록 방치한다. 실온에서 5 분 동안 12,000 x g의 원심 분리기. 조심스럽게 상부를 파이펫하고 신선한 1.5 mL 튜브로 옮김. 3.4.5단계의 튜브에 500 μL의 얼음-차가운 100% 에탄올을 넣고 튜브를 닫고 3배 아래로 부드럽게 뒤집어 섞습니다. 튜브를 -80°C에서 15분 동안 또는 -20°C에서 30분 동안 배양하고 추출을 계속하거나, 다음날 추출을 완료하기 위해 -20°C에서 하룻밤 방치한다. 미세원심분리기를 4°C로 설정하고 원심분리를 시작하기 전에 적어도 12°C로 식힌다. 13,000 x g에서20 분 동안 미세 원심 분리기및 원심 분리기에 튜브를적재하십시오. 상급제는 버리고, 70% 얼음차가운 에탄올로 교체하고, 원심분리기를 13,000 x g에서10분 더 돌립니다.참고: 70% 에탄올은 분자 등급의 뉴클레아제 프리 워터로 만들어야 합니다. 3.4.7 단계에서 모든 상급자를 버리고 튜브를 50 °C로 설정된 인큐베이터로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김. RNA/DNA 펠릿을 건조시키기 위해 20분 동안 배양합니다. 모든 에탄올의 증발을 가능하게 하기 위해 튜브를 부분적으로 열어 두십시오. 100 μL의 뉴클레아제 프리 워터를 마른 펠릿에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 3 s에 대 한 소용돌이 내용물 혼합.참고: 이 단계에서 추출물은 섹션 3.5가 수행될 때까지 -80°C에서 냉장고에 2-3일 이상 보관될 수 있다. DNA 제거참고: 이 단계는 추출물에 DNA가 존재하면 MBLA 결과를 무효화하기 때문에 매우 중요합니다. 이 섹션은 DNA 제거키트(재료 표)를기반으로 합니다. 샘플 수(완충액 10 μL 및 샘플당 DNase 1 μL)와 파이펫팅으로 인한 손실을 커버하기 위해 10% 추가로 DNase I 효소를 혼합하여 준비합니다. RNA 추출물을 함유하는 각 튜브에 11 μL의 피펫을 소용돌이치게 하여 혼합한다. 3s를 휘두를 때 섞은 다음 잠시 회전 (10 s 에서 13,000 x g)을사용하여 벽에 있는 물방울을 제거합니다. 37°C에서 30분 동안 뜨거운 블록 또는 인큐베이터에서 배양한다. DNase I 효소 1 μL을 각 튜브에 직접 넣고, 소용돌이에 의해 잘 섞고, 37°C에서 30분 동안 추가로 배양합니다. DNase 인큐베이션이 끝나기 10분 전에 DNase 불활성화 시약을 해동합니다. 소용돌이 20 s는 균질한, 유백색 현탁액을 보장한 다음 3.5.2 단계에서 각 RNA 추출물에 DNase 불활성화 시약 10 μL을 첨가한다. 5 분 배양 단계에서 5 분 동안 소용돌이 3x동안 실온에서 혼합물을 배양합니다. 혼합물을 13,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리합니다. RT-qPCR을 같은 날 또는 장기 보관을 위해 -80°C에서 실행하는 경우 RNA 추출물을 냉장고에 보관하십시오. 4. 역전사 qPCR 알 수 없는 샘플의 경우, RNase 자유 물에서 1:10 비율로 사용되는 모든 RNA 추출물을 희석합니다. 5s에 대한 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 잠시 물방울이나 기포를 제거하기 위해 아래로 회전. 표준 곡선에 대한 표준 시료의 경우 -80°C 냉동고에서 Mtb 및 EC RNA 표준을 취하고 실온에서 해동합니다. Mtb 및 EC 표준 샘플의 7개 및 6개의 10배 희석을 각각 확인합니다. 혼합물을 한 튜브에서 다른 튜브로 옮기기 전에 팁을 변경합니다.참고: 표준 샘플은 TB-MBLA 키트와 함께 제공됩니다. 마스터 믹스 준비참고: 마스터 믹스(MM)는 모든 시료, 표준 및 물을 증폭하여 템플릿 제어(NTC)를 충분히 증폭할 수 있는 PCR 시약의 용액입니다. NTC로서 사용되는 물은 MM을 추출 및 준비시키기 위해 사용되는 물과 동일한 물이어야 한다. RT-반응은 DNA 제거의 효율을 결정하는 대조군이다(표1). 각 PCR 반응 튜브에 MM의 16 μL을 전달합니다. 각 RT+ 및 RT-반응 튜브와 물을 NTC 반응 튜브에 4 μL의 RNA 추출물을 첨가합니다. 반응 튜브를 실시간 PCR 기계에 로드하고 다음과 같이 PCR 조건을 설정합니다: 30분 동안 50°C, 15분 동안 95°C, 94°C에서 40x 사이클, 45초동안 94°C, 녹색 및 노란색 채널에서 흡수되는 형광소로 1분 동안 60°C.참고: 녹색 채널은 Mtb 검출 형광포및 황색은 추출 제어 형광포골이다. 결과 해석참고: 동일한 샘플의 중복 반응이 1개 이상의 표준 편차로 다르지 않은지 확인합니다. Mtb 및 EC Cq 값이 30보다 높은 값은 음수로 간주됩니다. 자세한 해석 세부 정보는 표 2에서참조하십시오. 치료 반응을 해석하려면 표준 곡선을 사용하여 Cq 값을 박테리아 하중(eCFU/mL)으로 변환합니다. 치료 후속 기간에 걸쳐 세균 부하의 변화로 치료 반응을 읽는다.참고: 처리 다음 세균 성 부하에 있는 가을은 양성 반응을 의미합니다 (즉, 결핵 박테리아를 죽이는 항 결핵 약) 세균부 짐에 있는 아무 변경 또는 상승도, 반대로 결핵 약에 결핵 박테리아의 저항을 의미할 수 있는 또는 환자는 그들의 처리 복용량에 적당하게 고수하지 않는 부정적인 반응을 의미합니다. TB-MBLA에 의해 측정된 세균 부하의 하락은 배양 양성(TTP)에 대한 MGIT 시간의 증가와 상관관계가 있다. 5. 전송 전자 현미경 검사법 2 mL aliquots의 열 불활성화 배양 및 대조군을 2 mL 마이크로 원심 분리튜브로 옮김. 원심분리기 는 20,000 x g에서10 분 동안 . 상온액을 버리고 펠릿을 700 μL의 세포 고정 버퍼로 중단하고 실온에서 5분 동안 배양하여 세포를 고정시한다. 16,000 x g에서 30 분 동안 현탁액을 원심 분리하여 단단한 펠릿을 얻었다. 상급체를 버리고 인산완식염수린(PBS)에 1% 자당으로 교체합니다. 전자 현미경 검사법을 위해 단면화 될 때까지 4 °C에서 자당에 펠릿을 저장합니다. 단면 및 TEM참고 : 아래의 프로토콜은 그리피스 외28에서적응된다. 4°C에서 하룻밤 동안 PBS에 2.1 M 자당에 포함시킴으로써 세포 펠릿을 냉동 보호. 얼음으로 차가운 물로 3x 씻으소서. 액체 질소에 냉동 보호 세포 펠릿을 냉각하고 저온 미세 절제 스텁을 장착. 저온 마이크로토메를 사용하여 초박형 부분을 90 nm로 자른다. PBS에서 2% 메틸 셀룰로오스와 2.1 M 수크로오스의 1:1 혼합물의 텅스텐 와이어 루프를 사용하여 절단 섹션을 검색합니다. 피올로폼 코팅 된 150 메쉬 육각 구리 TEM 지지체 (그리드)로 섹션을 전송하고 4 °C에서 저장하거나 5.4.5 단계로 진행합니다. 우라닐 아세테이트의 그리드와 대조를 이루고 메틸 아세테이트 필름에서 공기 건조를 합니다. 얼음-차가운 물로 그리드를 세척한 다음 5분 동안 PBS 2방울을 떨어뜨리고 15-30분 동안 건조시십시오.참고: 모든 라벨링 단계는 주위 온도에서 수행된 세척 단계를 제외한 얼음 온도(액체 온도)에서 수행되었다.