تتبع أكسيد الحديد المغناطيسي المسمي الخلايا الجذعية المسسبيه باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الولادة في الأنف في أصابه الدماغ الرضية نموذج Murine
Summary
يقدم هنا بروتوكول لتسليم الخلايا الجذعية غير الغازية (MSC) وتتبع في نموذج الماوس من إصابات الدماغ الرضية. وتستخدم جسيمات نانويه أكسيد الحديد فائقه المغناطيسية كالتصوير بالرنين المغنطيسي (MRI) التحقيق لوضع العلامات MSC وغير الغازية في تتبع الجسم المجري بعد تسليم الأنف باستخدام الرنين المغناطيسي في الوقت الحقيقي.
Abstract
تعد العلاجات القائمة علي الخلايا الجذعية لإصابات المخ ، مثل إصابات الدماغ الرضية ، نهجا واعدا للتجارب السريرية. ومع ذلك ، تبقي العقبات التقنية مثل تسليم الخلايا الغازية وتتبع مع كفاءه زرع منخفضه التحديات في العلاج القائم علي الجذعية الانتقالية. توضح هذه المقالة تقنيه الناشئة لوضع العلامات الخلية الجذعية وتتبع استنادا إلى وضع العلامات علي الخلايا الجذعية المسمارية (MSCs) مع أكسيد الحديد المغناطيسي الفائق (SPIO) جسيمات نانويه ، فضلا عن تسليم الأنف من MSCs المسمية. هذه الجسيمات النانويه هي فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC)-جزءا لا يتجزا من وأمنه لتسميه MSCs ، والتي يتم تسليمها في وقت لاحق إلى أدمغه الفئران التي يسببها الدماغ عن طريق الأنف. ثم يتم تعقبها غير اينفاسيفيلي في الجسم الفعلي عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي في الوقت الحقيقي (MRI). وتشمل المزايا الهامه لهذه التقنية التي تجمع بين SPIO لوضع العلامات الخلية والتسليم في الأنف (1) غير الغازية ، في الجسم البحري تتبع MSC بعد التسليم لفترات طويلة تتبع ، (2) امكانيه أنظمه الجرعات متعددة بسبب غير الغازية طريق التسليم MSC ، و (3) التطبيقات الممكنة للبشر ، وذلك بسبب سلامه SPIO ، والطبيعة غير الغازية لطريقه تتبع الخلية عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي ، ومسار الاداره.
Introduction
الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) هي المرشحين جذابة للعلاجات القائمة علي الخلايا الجذعية في علاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي (CNS) والإصابات في البشر. وعلاوة علي ذلك ، استخدمت mscs كوسيلة لتسليم البروتينات العلاجية في مواقع الإصابات1،2. في السنوات الاخيره ، تم تطوير ابتكارات واعده لإنشاء 1) طرق جديده لتوصيل الخلايا و 2) تتبع الخلايا لعلاجات الخلايا الجذعية للاضطرابات العصبية. ويتوقف توصيل الخلايا الجذعية داخل المخ علي قدره الخلايا علي تجاوز الصفيحة المعدنية وإدخال اللمبة الشميه جزئيا عن طريق الطريقالثالث. وعلاوة علي ذلك ، فان توصيل الأنف بالأنف هو طريق أمن وغير غازي يسمح بالاداره المتكررة في غضون فتره قصيرة من الزمن.
توضح هذه المقالة تقنيه حساسة للغاية وغير الغازية لتعقب MSCs في الجسم المجري بعد الولادة في نموذج الماوس من إصابات الدماغ الرضية (الاصابه) ، التي توظف الخلايا المسمية SPIO والتصوير بالرنين المغناطيسي. ميزه واحده هامه من الوسم SPIO هو الكشف الحساسة من SPIO في الانسجه عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي ، مما يجعل من الممكن لتتبع الخلايا بكفاءة وغير اينفاسيفيلي. والجسيمات النانويه SPIO المستخدمة هنا متاحه تجاريا والموسومة مع فلوريسئين ايزوكلوروسيانات (FITC) فلوكوفيري, الذي يسمح للكشف عن SPIO في الانسجه دون المناعي أو معالجه اضافيه. وعلاوة علي ذلك ، فمن الممكن لأداء التتبع في الوقت الحقيقي الطولي والتحقيق في التوزيع الحيوي لل MSCs تسليمها.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا يمثل الإجراءات العامة لوضع العلامات SPIO من MSCs وتتبع التصوير بالرنين المغناطيسي من سبيسو المسمي MSCs بعد الولادة الداخلية. يسمح البروتوكول الفرصة لدراسة الهجرة والتوزيع الإحيائي لل MSCs بعد التسليم في الجسم الحيوي في الدماغ ، وذلك باستخدام طريقه غير الغازية.
Mscs هي المرشحين جذابة للعلاجات القائمة علي الخلايا الجذعية لاضطرابات CNS والإصابات بسبب قدرتها علي إفراز العوامل الغذائية التي 1) الزناد العمليات العصبية و 2) توفير نيوروبروتكايشن ، نظرا لأثارها المضادة للالتهابات داخل منطقه الاصابه9،10،11،12. علي الرغم من ان تتبع التصوير بالرنين المغناطيسي علي المدى الطويل والكشف عن MSCs المسمي SPIO قد تكون محدوده بسبب تخفيف SPIO بين الخلوية مع انقسام الخلايا ، يمكن الكشف عن الخلايا المسمية لمده تصل إلى عده أسابيع بعد زرع في أدمغه النماذج الحيوانية13.
كما هو موضح هنا بروتوكول وضع العلامات من MSCs مع الجسيمات النانويه SPIO المغلفة مع ديكسكان دون وكلاء التحويل. استعملت بروتوكولات أخرى يتلقى يكون في الأدب14,15,16. ومع ذلك ، في جميع الحالات ، يجب تعديل هذه البروتوكولات لنوع الخلية ، حجم SPIO ، وقت الحضانة ، وتركيز SPIO. وقد تبين ان MSCs قد ضعف التمايز تشوندروجينيك المحتملة ولكن لا التمايز اديبوغينيك علي الوسم SPIO17. ولذلك ، فمن المستحسن جدا ان يتم اجراء اختبارات التمايز قبل تسليم الخلايا الجذعية لتقييم تاثير SPIO علي قوه التمايز من الخلايا الجذعية. في دراسة سابقه, وقد ثبت ان MSC وضع العلامات مع نفس نوع SPIO والتركيز المستخدمة في هنا لا تؤثر علي قوه التمايز أو اديبوغينيك من MSCs6.
ان الطريق الداخلية لتوصيل الخلايا الجذعية العلاجية لاضطرابات المخ والإصابات هو نهج واعد للتطبيق السريري للخلايا الجذعية. ومع ذلك ، تظل أليات المتاصله والجزيئية التي تملي سلوكيات الخلايا الجذعية في تجويف الأنف غير واضحة. علي الرغم من ان يتم استكشاف الطريق داخل الأنف علي نطاق واسع لتسليم جزيئات صغيره ، يختلف حجم وسلوك التوزيع الحيوي لجذع العلاجية من جزيئات صغيره. يوضح البروتوكول الحالي ان MSCs تميل إلى الهجرة نحو موقع الاصابه بعد الولادة الداخلية.
هنا ، تم استخدام الصور الموزونة T2 * لتعقب MSCs المسمي SPIO. واستخدمت تقارير أخرى تصوير الصدى المتدرج. ومع ذلك ، غالبا ما لوحظ التحف الحساسية في التصوير صدي الانحدار بسبب البينية SPIO. وفي البروتوكول الحالي ، كان موقع المناطق التي تمثل المساحات الموجودة في المنطقة والذي يمثل MSCs المسمي سبيسو علي الصور المرجحة T2 * هو نفس موقع SPIO في أقسام المخ كما كشف عنها الفحص النسيجي (الشكل 3). وهذا يشير إلى حساسية كافيه من T2 *-المرجحة التصوير صدي تدور ل SPIO-المسمي MSC تتبع في الدماغ.
وباختصار ، فان البروتوكول الموصوف مفيد لدراسات تتبع الخلايا الجذعية لإصابات المخ واضطراباته. التتبع الطولي للخلايا الجذعية في الجسم الحي قد تم اجراؤه تقليديا من خلال التضحية بالماشية في نقاط زمنيه متعددة. يوفر البروتوكول الحالي نهجا غير الغازية وفعاله للتسليم MSCs وتتبع ، والذي يمثل اجراء محتمل للعلاج القائم علي الخلايا الجذعية لإصابات الدماغ واضطرابات في الإعدادات السريرية.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل وزاره العلوم والتكنولوجيا المنح, تايوان (معظم 104-2923-ب-038-004-MY2, معظم 107-2314-ب-038-063, ومعظم 107-2314-ب-038-042) وجامعه تايبيه الطبية (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400 ، DP2-21121 -01 و DP2-108-21121 -01-N-05-01).
Materials
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
| Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
| Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
| Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
| Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
| ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
| Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
| Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
| Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
| MRI scanner | Bruker Biospec | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
| TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |
Referencias
- Pelled, G., et al. Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon. Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).
- Shahror, R. A., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. Journal of Neurotrauma. , (2019).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).
- Karussis, D., et al. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Cell Transplant. 23, 123-139 (2014).
- Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., Chopp, M. Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury. Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275, 411-426 (2016).
- Ohtaki, H., et al. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).
- Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).
- Hoehn, M., et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).
- Reddy, A. M., et al. In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI. Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).
- Roeder, E., et al. Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study. PLoS ONE. 9 (5), e98451 (2014).
- Schafer, R., et al. Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability. Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).
- Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis. NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).
