ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

1. תרבית תאים התרבות בתחומי העניין במדיית תרבות מתאימה. פניצילין-סטרפטומיצין ניתן להוסיף כדי למנוע זיהום. במקרה של תאים HepG2, התרבות תאים בתקשורת התרבות המכילה בינונית שונה של מדיום של הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום בפרה עוברית (FBS) ו 0.1% פניצילין-סטרפטומיצין. כדי faciltate מדידות מדידה ראמאן, תאים ניתן לגדל על 0.1% מצופה ג’לטין זכוכית בתחתית הצלחת או שקופיות קוורץ. התאים הדגירה עבור 2 ימים ב 37 ° צ’ ו 5% CO2 בחממה לחות. סנכרון תרביות תאים כדי להגיע ל70% שליטה. התאים תת-תרבות לתוך הצלחת 35 mm זכוכית התחתית או שקופיות קוורץ באמצעות בינוני זהה בצפיפות הזריעה של 0.7 x 106, ולאחר מכן הדגירה ב 37 ° צ’ עבור 24 h.הערה: מנות תרבות או שקופיות יכול להיות מצופה מראש עם קולגן או ציפוי הג פתרון עם יחס פני השטח של התרבות של 5 ו/cm2 כדי לאפשר להם לתקן, הבטחת ההישרדות שלהם במהלך המדידה. 2. טיפול בסמים הסר את תרביות התאים מהאינקובטור ושטוף את 2x עם מאגר PBS מחומם (37 ° c).הערה: מיטבי להסיר תאים לטיפול בסמים בשטף של 50%-60%. חלוקת תאים לקבוצות מטופלות שטופלו בסמים ולא מטופלות במנות תרבות 35 מ”מ. מערבבים את סם הבחירה עם מדיית התרבות. לדוגמה, התמוססות טממוקסיפן ב-diמתיל סולפוקסיד (DMSO) וערבבו עם מדיית התרבות כדי להשיג נפח סופי של 2 מ ל וריכוז טמוקסיפן של 10 μM. . זו תהיה הקבוצה המטופלת בסמים לערבב נפח המתאים של ממס (DMSO) לתוך המדיום כפקד ללמוד את ההשפעות של DMSO. . זו תהיה קבוצת הביקורת מודטה שתי הקבוצות ב 2 מ ל של מדיה מחודדים שהוכנו בשלבים 2.3-2.4 עבור 24 שעות. השטף הצפוי לאחר הדגירה צריך להיות 70%-80%. 3. הדמיה ספקטרלית ועיבוד ספקטרלי הערה: למרות שמערכות ספקטרוסקופיית ראמאן מסחריות זמינות, מערכת הספקטרוסקופיית המשמשת בבית היא מיקרוסקופ ביתי לסריקת קו שתוארה קודם לכן7,8. בקצרה, מערכת זו מצוידת 532 ננומטר לייזר דיודה מוצק שאוב המדינה. אור לייזר מעוצב לתוך מטוס באמצעות עדשת גליל, אשר מאפשר מדידה של 400 ספקטרום בחשיפה אחת. ספקטרום ראמאן נרשמו באמצעות מצלמה מקורר CCD רכוב על polychromator המשתמשת 1,200 חריצים/מ”מ פומפיה כדי למקסם את הרזולוציה הספקטרלית של אזור טביעת האצבע (מ 500-1800 ס מ-1). אזור ספקטרלי זה מכיל צפיפות גבוהה של תדרים ספציפיים מולקולות המייצר פיזור ראמאן. ניתן להשתמש בעדשת המים האובייקטיבית (NA = 0.95). הרזולוציה המרחבית של מערכת זו היא ~ 300 ננומטר והרזולוציה הספקטרלית היא1 ס מ -1. כדי להבטיח הישרדות תא במהלך הניסוי, מיקרותא קבוע על הבמה מיקרוסקופ ממונע משמש. , לפני המדידות הספקטרליות. בדוק את היישור של האופטיקה חריר 50 יקרומטר ניתן להשתמש כדי לוודא כי חריר ומיקום לייזר להתאים בדיוק. הזן את הספקטרוסקופיה כאשר לצמצמה ככל האפשר. השתמש אתנול לכייל את הספקטרוסקופיה לפני כל ניסוי. כדי לעשות זאת, מקום אטוח בצלחת זכוכית תחתית, למדוד את הספקטרום בעוצמת לייזר נתון (נמדד במדגם) עבור 1 s, ולשייך את השיא לאורכי גל ידוע7. מזער את עוצמת הלייזר במדגם כדי ~ 2.4 mW/μm2 כך תאים לשרוד חשיפה לייזר. הגדר את המיקרוחדר ב 5% CO2 ו 37 ° c. לאחר מערכת המיקרוסקופ הוא מוכן, להסיר תאים מתוך החממה ולשטוף מיד את התאים 2x עם מאגר PBS (37 ° c), ולאחר מכן להוסיף 2 מ ל של PBS מחומם (37 ° c) או DMEM כדי להשעות מחדש את התאים.הערות: שניהם PBS ו-FluoroBrite מדיה מבוססי המדיה הם מספיק אפשרויות עבור מדידות ספקטרוסקופית ראמאן כי הם מייצרים אות רקע מינימלי. הוסף 10 μL של מים על העדשה היעד טבילה במים ולמקם בעדינות את הצלחת הזכוכית התחתונה התא על הבמה המיקרוסקופ. למדוד כל תא על ידי התמקדות קו הלייזר. זמן חשיפה של 15 s לכל תא מספיק כדי לקבל חתך של תא עם אות ראמאן ברור. מראה גאלבנו מאפשר סריקה של תא אחד או קבוצה של תאים בתוך כמה עשרות דקות.הערות: ברזולוציה גבוהה יותר של הדמיה ספקטרלית מלאה של תאים דורש זמן רב יותר והוא עלול לגרום לנזק פוטותאי. כאן, התאים נמדדו באמצעות חשיפה של שורה אחת כדי לקבל חתך רוחב של כל תא. גישה זו היא החלפה טובה להגדלת התפוקה והשגת מידע מספיק לתאים מפלים, תוך הקפדה גם על הכדאיות של התאים על-ידי הגבלת הנזק לתמונות. 4. עיבוד מקדים של נתונים ספקטרליות וניתוחים רב-משתנים הערה: עיבוד מקדים הוא צעד הכרחי לפני ניתוח נוסף כדי להסיר וריאציות טכניות לא רצויות בתוך הנתונים הספקטרליות. בשל גיוון של שיטות ותוכנה, לא ניתן לספק רשימה ממצה, ויש ביקורות רבות שימושיות שנמצאו בספרות7,8. בסעיף זה, אנו מתארים בקצרה את הגישה המשמשת לניתוח ולפרש מידע ראמאן ספקטרלי שהתקבלו מתאים בודדים חיים. לחלץ ולקדם מראש תמונות ראמאן כדי להסיר הפרעות הקרן הקוסמית אפשרי.הערה: ציר ספקטרלי של ספקטרום שהושג במהלך ימים שונים/שבועות/חודשים עשויים לכלול כמה וריאציות בשל וריאציות טכניות קטנות במהלך כיול באמצעות אתנול. פעולה זו תשפיע מאוד על ניתוחים מרובי משתנים והשוואות סטטיסטיות. במקרה שניסויים מתבצעים במהלך שבועות/חודשים שונים, צפויות וריאציות אופטיות קטנות. במקרה זה, הנתונים יש לבצע אינטרפולציה כדי לתקן בסופו של דבר שינויים ספקטרלי של הנתונים על פני ניסויים. אינטרפולציה באמצעות ליטת חיבור מעוקב משמש כאן. לאחר שלב זה, יש ליישר את כל צירי הספקטרום. מגוון של 500-1800 ס”מ-1 נחשב לניתוח שלאחר מכן. חילוץ נתונים ספקטרלי של תאים ורקע (העדר תאים) מכל תמונה באמצעות אלגוריתם תוצרת בית. הפחת את אות הרקע מהאות של התא. לאחר מכן, ממוצע הספקטרום של הפיקסלים הנותרים, שאמור להתאים לתא בודד. השלבים הבאים מתבצעים באמצעות ספקטרום דו-ממדי של תאים. בצע תיקון בסיסי באמצעות ModPoly9 או כל אלגוריתם אחר שנאמד בהתאמה מספקת. חתוך את טווח ספקטרלי 600-1700 ס”מ-1 כדי לבחור את אזור טביעת האצבע ולהבטיח כי אין תופעות הקצה לא רצויות על הספקטרום עקב התאמה פולינומיאלית רע. בצע שלב נורמליזציה כגון נורמליזציה וקטורית (עוצמה בכל מספר גל מחולק על-ידי הנורמה l2 הגלובלית או ערך מרבי של ספקטרום) כדי לנרמל את העוצמה הספקטרלית10, למרות שניתן לשקול התאמות אחרות. הכן ערכת נתונים עם התווית המתאימה עבור כל מחלקה/תנאי.הערה: ניתוח ספקטרלי השוואתי יכול להיות מנקב כדי לחקור את האופי של הבדלים אפשריים בין מחלקת התאים/התנאים (למשל, על ידי הפחתת הספקטרום הממוצע של קבוצת הבקרה לקבוצות אחרות כדי לזהות אזורי עניין [כגון סמנים פוטנציאליים]). בנוסף, ניתן לבצע חישובים של מבחנים של ANOVA ופישר ב-10. כדי לזהות תאים מטופלים ולא מטופלים המבוססים על תכונות ספקטרליות, ניתן להחיל ניתוחים רב-משתנים. יש להשתמש בנתונים ספקטרלי מנורמאליים כערכת נתונים של הדרכה, וערכת נתונים לא ידועה (ללא תווית) מניסוי שכפול צריכה לשמש כנתוני בדיקה, במידת האפשר.הערה: אנליזה דיסקרימינטית שבוצעה על וקטור כלשהו של ניתוח רכיב עיקרי (PCA-DA10), הקרנה על ציונים סמויים ואחריו ניתוח מבדיל (PLS-da), תמיכה מכונות וקטורים (svm)11 הם דגמים המשמשים לעתים קרובות בתחום, וכל אחד מציג שיקולים סטטיסטיים שונים. יש לבצע עיבוד מקדים של נתונים כתוצאה מכך. השתמש בלמידה ממוחשבת המתאימה למטרות הנסיוניות. כאן, הקרנה על מבנה חבוי (PLS) מודל בנויה באמצעות אזור טביעת אצבע ספקטרלית של ראמאן ספקטרום (600-1710 ס”מ-1)11,12. ממוצע-המרכז את הנתונים בהתאם לצורך. עבור אימות צולב של המודל, ניתן להחיל טכניקות שונות.הערה: הנה, מוחל אימות צלב ונציאני עיוור עם 10 פיצולים. יש לבדוק את מורכבות המודל (מספר הרכיבים או המשתנה הנסתר) כך שהמודל הטוב ביותר ממזער את ערך השגיאה הריבועי הממוצע (RMSE). נמצא כי שלושה וקטורים סמויים (LVs) סיפק את האפליה הטובה ביותר עם ערכת הנתונים שלנו. לזהות אילו פסגות ספקטרליות לתרום לאפליה של התאים (למשל, על ידי התוויית ניקוד של חשיבות משתנה בהקרנה [VIP] עבור כל מספר גל ראמאן או את הגודל של מקדם הרגרסיה).הערות: תוצאת ה-VIP של משתנה מחושבת כסכום משוקלל של היחסים בריבוע בין רכיבי PLS-DA והמשתנה המקורי. פרטים לגבי PLS ואלגוריתם VIP ציונים ניתן למצוא את הספרות11,12. 5. הגדרת דגימה של תא יחיד ופרוצדורות לתקן את מערכת דגימת התא על מיקרוסקופ ראמאן כפי שמוצג באיור 1. חברו את המיקרומניפולציה התלת-ממדית למחזיק הנימי זכוכית המצורף למזרק ריק לדגימת מציצה על-ידי החלת לחץ שלילי (איור 1). הגדר את המיקרוסקופ לשדה הגדלה גבוהה (40x) כדי להתבונן בקצה נימי הזכוכית וודא שהוא אינו שבור. שלוט במיקום של נימי הזכוכית באמצעות המיקרומניפולציה (x-, y-ציר z). ודא שעצת הקפילר ממורכזת בשדה התצוגה, ולאחר מכן הזז את הקפילר על ציר z כדי לתת סיווג לתבשיל התרבות מאוחר יותר.הערה: מיקרודגימה של התאים מבוצעת על ידי נימי זכוכית עבור תאים עם קטרים בין 10-15 μm. קפילר עם גודל משעמם של ~ 5 יקרומטר מומלץ. אם הגודל נשא קטן מדי, העצה נימי יהיה מחובר על ידי התא, ואם הוא גדול מדי, את הרגישות של מדידות MS מאוחר יותר עלולים להיות בסכנה. מניחים את צלחת המדגם/צלחת על הבמה של המיקרוסקופ, להתאים את ההגדלה ולהתמקד, לבחור את תא היעד על מנת הרשת, ולהעביר אותו למרכז התצוגה. לאחר מכן, הורידו בזהירות את נימי הזכוכית באמצעות המיקרומניפולציה (ציר z) עד שהקצה מגיע לפוקוס.הערה: הקפד לא להזיז את הקפילר בצירי ה-x ו-y עד שהנימי יהיה בפוקוס. תחת התבוננות מיקרוסקופית, לגעת תא בודד היעד עם טיפ נימי, ואז להתחיל להחיל לחץ שלילי באמצעות המזרק כדי ללכוד את התא בתוך הקצה נימי. הקלט הליך זה על-ידי לקיחת תמונה או וידאו כדי לבדוק את העיתוי ולמצוץ את המיקום של התא בדיוק, במידת הצורך. הזיזו את הנימים למעלה על ציר z. אז, לנתק את הקפילר מבעל נימי באמצעות מלקחיים לקראת ניתוח MS. 6. מדידות ספקטרומטר מסה כיול הדיוק ההמוני של כלי MS בהתאם להמלצות היצרן. לאחר הכיול, ודא ששגיאת המסה אינה גדולה מ-3 דפים לדקה. מטב את כלי MS לפרמטרים המתאימים ביותר עבור מכשיר הריבית.הערה: במקרה של טמוקסיפן וניתוח 4-OHT, הפרמטרים של המכשיר מוגדרים להלן: הטמפרטורה קפיצית: 400 ° c, תרסיס מתח: 1500 V, היעד בקרת רווח אוטומטי (AGC): 5.00 E + 06, S-עדשה RF ברמת: 90%, ה-SIM טווח: 347-397 m/z, הזמן ה200 ms, החלטה SIM: 140,000 FWHM, MS/MS טווח: 50-400 m/z, MS/MS היעד AGC: 2.00 E + 05, MS/MS זמן ההזרקה מקסימום: 100 ms, MS/MS החלטה: 17,500 FWHM, ms/ms בידוד חלון: 1 m/z, MS/טרשת נפוצה התנגשות (בשעה) הגדרת שיטת רכישה אוטומטית עם משך של 5 דקות למצב ה-SIM כדי להשיג כימות יחסית, ושיטת MS/MS אחרת לזיהוי חיובי של התרופה ואת המטטבוליט שלה. יש להגדיר את הפרמטרים של שיטת הרכישה לערכים המוטבים שהוזכרו בשלב 6.2. הכינו את הממיסים. מתחת למכסה המנוע הרכב הממס תלוי באנליטה של הריבית. כאן, הממס אורגני בשימוש מורכב 80% meoh, 10% dmso, ו 0.1% החומצה פורמית. מערבבים תקן פנימי מתאים עם הממס האורגני לפני המדידות. בניסוי זה, 5.31 nM של d5-טמוקסיפן משמש כסטנדרט פנימי. כדי להימנע מתוצאות חיוביות מוטעות, מחלקים את המדיה המקיפה את התאים שטופלו בתרופה באמצעות קפילר בגודל 1 יקרומטר עם התבוננות מיקרוסקופית מתמדת כדי להימנע מדגימת חלקים סלולריים. הוסף 2 μl של הממס יינון לקצה רחב של נימי המכיל את התקשורת באמצעות פיפטה המצורפת טיפים מטעין. לאחר מכן, לנתח את המדיה שנדגמו על ידי MS, לבדוק את הנוכחות של הניתוח של הריבית (בדרך כלל, זה לא צריך להיות ניתן לזיהוי). הוסף 2 μl הממס יינון לקפילר המכיל את התא, לתקן את הנימים למתאם התרסיס ננואלקטלי (nano-ESI) מחובר ספקטרומטר מסה מתאים, ולהתחיל את שיטת הרכישה האוטומטית. 7. עיבוד וניתוח נתונים בספקטרומטר מסה הערה: ניתן להשתמש בכל תוכנה מתאימה לביצוע ניתוח נתונים. עם זאת, אם החוקרים מעוניינים לבצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנה שאינה מסופקת על-ידי ספק MS, אז יש להמיר את הנתונים הגולמיים מתבנית הספק הקניינית לתבנית פתוחה או כקובץ טקסט ראשון (שנעשה כאן). נרמל את הנתונים על-ידי חלוקת אזור השיא של האנליטה של הריבית (s) של התקן הפנימי מאותה סריקת MS. לאחר מכן, התחבר לשינוי יחסי השיא כדי להקטין את ההטיה. התווה את העוצמה המנורמלת של התרופה או את המטלילייט שלו בתור מזימת הרשת או עקומת הדחיסות כדי להמחיש את ההתפלגות בין תאים בודדים. כאן, משתמשים בתוכנה סטטיסטית R, יחד עם חבילת ggplot2. לחשב את התרופה מטבוליזם ליחס התרופה בלתי מטבוליזם על ידי חלוקת השפע של מטבוליזם התרופה על ידי זה של מולקולת ההורה הבלתי מטבוליזם בכל תא (כלומר, 4-OHT ו טמוקסיפן, בהתאמה.הערה: הקורלציה בין וריאציות של פסגות ראמאן מסוים של ריבית הווריאציות בפסגות MS של התרופה או מטבוליטים שלה ניתן ללמוד. זוהי תוספת לקורלציה אפשרית בין הסם עצמו לבין המטטבוליט שלו בתאים בודדים. ניתן לעשות זאת על-ידי חישוב מקדם המתאם פירסון באמצעות מבחן דו-זנבי. יש לשקול גם גישות מתקדמות יותר אינטגרטיבית.