Viene presentato un protocollo per la sintesi di oligomeri peptoidi codificati in informazioni e per l’autoassemblaggio di questi peptoidi diretti in sequenza in scale molecolari utilizzando ammine e aldeidi come coppie dinamiche di reazione covalenti e Lewis acida rara terra triflates in metallo come reagenti multiruolo.
Questo protocollo presenta l’uso di reagenti multiruolo acidi di Lewis per aggirare l’intrappolamento cinetico osservato durante l’autoassemblaggio di fili oligomerici codificati in informazioni mediati da interazioni covalenti dinamiche accoppiate in modo da imitare il ciclo termico impiegato comunemente per l’auto-assemblaggio di sequenze di acido nucleico complementari. I monomeri di ammina primaria che portano aldeide e le moieties acionte di ammina sono funzionalizzati con gruppi di protezione ortogonale per l’uso come coppie dinamiche di reattori covalenti. Utilizzando un sintetizzatore peptide automatizzato modificato, i monomeri di ammina primaria sono codificati in filamenti oligo (peptoide) attraverso la sintesi di submonomeri in fase solida. Dopo la purificazione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la caratterizzazione mediante spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray (ESI-MS), gli oligomeri specifici della sequenza sono sottoposti ad alto carico di un triflate di metalli acidi nocivi Lewis che sconvolge entrambe le mogli di aldeide e colpisce l’equilibrio della coppia di reattori in modo tale che i filamenti completamente dissociati. Successivamente, viene estratta una frazione dell’acido di Lewis, consentendo l’analizzazione di fili complementari specifici della sequenza di formare scale molecolari codificate in informazioni caratterizzate da spettrometria di massa di desorption/ionizzazione laser assistita a matrice (MALDI-MS). La semplice procedura descritta in questo rapporto aggira le trappole cinetiche comunemente sperimentate nel campo dell’assemblaggio covalente dinamico e funge da piattaforma per la progettazione futura di architetture robuste e complesse.
Il progresso nell’auto-assemblaggio, il processo mediante il quale piccole sottounità generano architetture più grandi attraverso percorsi termodinamicamente guidati, ha offerto un migliore controllo sulle nanostrutture macro e sopra-molecolari tipicamente sfruttando interazioni intermolecolari come l’impilamento z e il legame di idrogeno1,2,3,4. In particolare, gli acidi nucleici (cioè i polinucleotidi) sono emersi come mezzi di nanocostruzione straordinariamente versatili, in quanto l’elevata densità di informazione fornita dall’abbinamento base Watson-Crick consente l’assemblaggio di strutture complesse e selettive in sequenza4,5. Mentre la resistenza intrinsecamente bassa di questi legami intermolecolari transitori consente il riarrangiamento e la correzione degli errori delle sottounità, le strutture risultanti sono spesso suscettibili alla degradazione termica e meccanica6. Al contrario, le interazioni covalenti dinamiche7,8,9, una classe di reazioni covalenti che formano obbligazioni che sono reversibili o riordinabili in condizioni miti e sono state recentemente impiegate per produrre complesse macromolecole come scale10,11,12,13, gabbie14,15,16e pile17, offrono maggiori punti di forza del legame e strutture robuste. Purtroppo, la capacità di riarrangiamento e di controllo degli errori è diminuita dai tassi di riorganizzazione relativamente bassi di queste specie covalenti, riducendo la loro capacità di auto-assemblaggio nei prodotti desiderati18. Per affrontare questa intrappolamento cinetico, i catalizzatori o le dure condizioni di reazione vengono spesso utilizzati in combinazione con semplici blocchi di costruzione. Qui, riportiamo un processo che aggira l’intrappolamento cinetico per consentire l’autoassemblaggio di scale molecolari da oligomeri specifici della sequenza in cui l’ibridazione è diretta dalle informazioni codificate nelle sequenze residue dell’oligomero.
Data la loro accessibilità sintetica, i poli (glicine sostituiti con N) (cioè peptoidi) sono impiegati come precursori oligomerici da cui vengono assemblate le scale molecolari19. I peptoidi sono isomeri strutturali di peptidi in cui i gruppi di ciondolo sono apposti sull’azoto trasmesso dalla spina dorsale invece di essere accoppiati con il20. Utilizzando la sintesi in fase solida, si ottiene prontamente il posizionamento esatto di gruppi di ciondolo covalenti dinamici lungo la catena peptoide, consentendo la progettazione di oligomeri precursori in grado di assemblarsi in complesse strutture sopramolecolari21.
Il riarrangiamento covalente dinamico della connettività imine è impiegato in questa procedura come la reazione di condensazione che genera imine fornisce un mezzo conveniente per caratterizzare l’auto-assemblaggio da spettrometria di massa come ogni legame formato si traduce in una riduzione di massa di 18 g/mol22. Inoltre, l’equilibrio tra i reati dell’ammina e l’aldeide e il prodotto dell’imine può essere variato alterando la concentrazione acida. In particolare, i triflati metallici di terre rare sono usati per influenzare l’equilibrio e inoltre deproteggere le aldeidi acetali protette con etilene23,24,25. Da notare, il triflate di scandio è già comunemente usato nel campo dell’autoassemblaggio covalente dinamico, compreso il suo recente successo nell’aiutare la sintesi di quadri organici covalenti (COF) a temperatura ambiente26,27. Inoltre, la solubilità contrastante delle sequenze oligo (peptoide) e del trigonfio metallico di terre rare consente il controllo dell’equilibrio attraverso l’estrazione di liquidi. Il processo riportato utilizza questo controllo per aggirare le barriere cinetiche che impediscono l’auto-assemblaggio diretto dalle informazioni.
La tecnica qui descritta descrive l’assemblaggio covalente dinamico di oligomeri peptoidi che portano informazioni, dove le informazioni sono codificate nella sequenza dei loro gruppi di ciondolo. L’uso di un monomero di ammina protetto da Alloc in combinazione con un monomero di aldeide etilene protetto da acetal consente la deprotection ortogonale, consentendo la deprotezione di Alloc sul tallone e la deprotezione acetale in situ durante la reazione di auto-assemblaggio, garantendo così che le sequenze sintetizzate non reagiscano prematuramente prima della purgomerificazione e della caratterizzazione delle oligogoni. È importante sottolineare che la sintesi in fase solida viene eseguita utilizzando una resina fotolabile per consentire la scissione dell’oligomero dal tallone sotto l’irradiazione UV o della luce viola, precludendo la deprotezione prematura del gruppo di protezione acido-labile e basato sull’etilene acetal. Si potrebbero considerare diversi sistemi alternativi di disprotezione. Per esempio, inizialmente abbiamo impiegato gruppi dual acid-labile di protezione (Boc-ammine e etilene acetal-aldeide) con l’intenzione di deprotection in situ da un forte acido seguito con neutralizzazione per consentire alla reazione di auto-assemblaggio di procedere; tuttavia, questo approccio ha provocato l’immediata generazione di precipitati dopo l’aggiunta di base. In alternativa, la protezione dell’ammina con un gruppo di protezione fotolabile, 2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl (NPPOC), è stata concepita in quanto l’aldeide potrebbe essere deprotetta selettivamente dopo il trattamento con acido trifluoroacetico (TFA) prima della purificazione. Purtroppo, la fotolisi in situ del gruppo protettore con luce UV non ha permesso la deprotection quantitativa, anche in presenza di fotosensibilizzanti e dopo lunghi periodi di irradiazione25. Trimethylsilylethoxycarbonyl (cioè Teoc) può essere impiegato come gruppo di protezione delle ammine ed è soggetto a scissione dopo il trattamento con trigoni metallici di terre rare; tuttavia, la deprotection quantitativa del Teoc richiede carichi triflate metallici di terre rare molto più elevati di quelli necessari per la deprotection acetale di etilene. Per questo protocollo, possono essere utilizzate aree di Teoc-ammine, ma la concentrazione di acido di Lewis deve essere regolata di conseguenza in quanto la deprotection dell’ammina sottoquantitativa potrebbe rivelarsi problematica per le strutture più grandi auto-assemblate. I gruppi funzionali alipatici sono stati brevemente considerati, ma la deprotezione delle aldeidi alipatiche richiede condizioni difficili che troncano le sequenze peptoidi32,33.
L’incorporazione di Neee e Nma come residui di stanziamento inerte serve a migliorare la solubilità degli oligomeri e a consentire alla facile marcatura di massa degli oligomeri precursori di permettersi una pronta identificazione delle specie generate mediante spettroscopia di massa. Inoltre, data la conformazione “strand” dei peptoidi in cui i segmenti della spina dorsale adiacenti adottano stati rotazionali opposti per formare un oligomero lineare, senza torsioni34,35, sequenze che incorporano residui di distanziali dinamici e inerti alternati facilita notori in cui i gruppi di pendenti reattivi sono orientati nella stessa direzione. Data la versatilità del metodo dei submonomeri, è possibile impiegare una vasta e diversificata libreria di ammine primarie per modificare ulteriormente gli oligomeri peptoidi, ma può richiedere modifiche al protocollo per mantenere un’elevata efficienza di accoppiamento.
Mentre gli oligo(peptoidi) possono essere sintetizzati manualmente in un vaso di reazione di vetro19, l’automazione del processo riduce il tempo per ogni aggiunta di residuo da diverse ore a mezz’ora. Inoltre, l’automazione riduce la quantità di rifiuti di solvibili monomeri e di lavaggio, particolarmente desiderabili quando si utilizzano monomeri di ammina primaria che non sono disponibili in commercio. Anche se la cleavazione Alloc dai residui di ammina protetta è una reazione efficiente, l’ossidazione del palladio può provocare una deprotezione incompleta. Di conseguenza, si suggerisce di testare una parte della resina e caratterizzare l’entità della deprotection con ESI-MS. Per i scissioni di prova, 30 min under 405 nm irradia peptoide sufficienti per la spettrometria di massa. La deprotection parziale può essere limitata con l’uso di condizioni anaerobiche o ripetendo la reazione di deprotection.
Mentre questo articolo si concentra su Sc(OTf)3 come reagente multiruolo, altri triflate di metallo di terre rare, come lo ytterbium triflate, hanno dimostrato di mediare con successo l’assemblaggio di scale molecolari orientato alle informazioni. In particolare, Sc(OTf)3 è il più acido Lewis dei triflate metallici di terre rare; pertanto, a causa della ridotta capacità catalitica offerta da altri trigoni metallici di terre rare24,36, possono essere necessari equivalenti maggiori per effettuare la completa deprotection acetale di etilene e la dissociazione del filo. Il numero di equivalenti necessari può essere determinato con la spettrometria di massa MALDI osservando il punto in cui i fili si dissociano completamente. La dissociazione è fondamentale nel processo di auto-assemblaggio ed è analoga allo scioglimento dei filamenti di acido nucleico a temperature elevate. La successiva estrazione del catalizzatore consente la formazione e l’interruzione di accoppiamenti covalenti dinamici che propagano l’assemblaggio di duplex specifici della sequenza. Questa graduale annessione dei fili oligomerici aggira l’intrappolamento cinetico (che, per le scale molecolari, può produrre specie fuori registro o sequenze di coppia in modo errato) sperimentate con altri metodi.
Cloroformio è un ottimo solvente come separazione di fase nel sistema cloroformio / acetonitrile / acqua ternaria utilizzato qui promuove l’estrazione parziale di acido Lewis senza provocare precipitazioni di strutture auto-assemblate37. Inoltre, il cloroformio è uno dei pochi solventi che promuove la formazione di imine pur mantenendo la solubilità della scala molecolare. Le quantità di tracce di duplex out-of-registry e accoppiati in modo non corretto possono essere spesso osservati a causa della natura dinamica del sistema. Anche se questo sistema è in gran parte inalterato da piccole variazioni nelle concentrazioni di triflate di metalli di terre rare al momento dell’estrazione, a volte, l’insufficiente estrazione del catalizzatore genera una porzione significativa di ibridazione incompleta e accoppiamenti di oligomeri non specifici. In questo caso, è generalmente preferibile ri-dissociare con altri 1,5 equivalenti di catalizzatore e quindi estrarre una seconda volta piuttosto che riestrarre immediatamente, poiché la dissociazione completa di singoli fili è vitale per il processo. Per assemblare contemporaneamente diverse scale molecolari con codifica di informazioni uniche, potrebbe essere necessario aumentare la concentrazione della soluzione di stock triflate metallico di terre rare utilizzata per mantenere equivalenti e volume di reazione totale.
Mentre questi auto-assemblaggi sono principalmente caratterizzati da spettrometria di massa, sono possibili altre tecniche tra cui il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET). Le limitazioni includono la quantità di materiale necessaria, la convenienza dei monomeri e il rapporto segnale-rumore. Le tecniche che richiedono solventi, come 1H NMR, possono inoltre soffrire di insolubilità di strutture auto-assemblate. Inoltre, le concentrazioni di triflate metallici di terre rare dopo l’estrazione possono essere determinate attraverso metodi come ICP-MS o 19F NMR con uno standard interno.
Man mano che progredisce verso un migliore controllo sulle nanostrutture e sui materiali macro e sopra-molecolari, si pone la sfida di progettare e fabbricare assiemi regolari, ma modificabili. Il protocollo descritto in questa relazione fornisce un percorso per raggiungere tali nanostrutture attraverso assembly selettivi di sequenza attraverso interazioni covalenti dinamiche.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti, Ufficio delle Scienze, Scienze dell’Energia di base, sotto il premio #DESC0012479. S.C.L. riconosce il sostegno del National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, e A.F.A. riconosce il sostegno di Abu Dhabi National Oil Company (ADNOC).
1,4-Dioxane | Fisher Scientific | D1114 | Certified ACS |
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) | Millipore-Sigma | 54793 | Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5% |
4-(2-Aminoethyl)aniline | Ontario Chemicals | A2076 | 98% |
4-Cyanobenzaldehyde | Oakwood Chemical | 049317 | 99% |
4-Methylpiperidine | TCI America | P0445 | ≥98.0% |
4-Toluenesulfonyl chloride | Oakwood Chemical | BR1703 | 99% |
50 mL High Performance Centrifuge Tubes | VWR International | 21008-240 | Centrifuge Tubes used for automated synthesizer |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Glacial |
Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10 | Certified ACS |
Acetonitrile | Millipore-Sigma | 34851 | For HPLC; Gradient grade; ≥99.9% |
All-plastic Norm-Ject syringes | Thermo Fisher Scientific | S7510-10 | Luer-Slip Syringe |
Allyl chloroformate | Acros Organics | 221741000 | 97% |
Bromoacetic acid | Alfa Aesar | A14403 | ≥98.0% |
Chloroform | Millipore-Sigma | 288306 | Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
Chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules |
Dichlorodimethylsilane | Acros Organics | 1133100 | ≥99.0% |
Dichloroethane | Fisher Scientific | E175 | Certified ACS |
Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | Stabalized; Certified ACS |
Diethyl ether | Acros Organics | 615080010 | Anhydrous; ACS reagent |
Diethylene glycol monoethyl ether | TCI America | E0048 | ≥99.0% |
Ethanol | Decon Labs | 2701 | 200 Proof; Anhydrous |
Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178 | Certified |
Fmoc-Photolabile SS resin | CreoSalus | SA50785 | 100-200 mesh; 1% DVB |
Glass Peptide Vessel | Chemglass | CG-1866-02 | Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread |
LC-6AD HPLC pumps | Shimadzu Corporation | Equipment | |
LED 405nm | ThorLabs | M405L2-C1 | 405 nm LED used for photocleavage of peptoid |
LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | Driver for LED light used in photocleavage of peptoid |
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer | CEM Corporation | Equipment | |
Lithium aluminum hydride | Millipore-Sigma | 199877 | Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture |
Luna C18 analytical RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4252-E0 | Equipment |
Luna C18 prepatory RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4253-P0-AX | Equipment |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | Certified ACS |
Microliter Syringe | Hamilton Company | 80700 | Cemented Needle (N) |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | Oakwood Chemical | M02889 | ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization |
N,N-Dimethylformamide | Millipore-Sigma | 319937 | ACS reagent; ≥99.8% |
Nitric acid | Fisher Scientific | A200-212 | Certified ACS Plus |
Nitrogen gas | Cryogenic Gases | Contents under pressure, may explode if heated | |
Phenylsilane | Oakwood Chemical | S13600 | 97% |
Prominence SPD-10A UV/vis Detector | Shimadzu Corporation | Equipment | |
p-Toluenesulfonic acid monohydrate | Millipore-Sigma | 402885 | ACS reagent; ≥98.5% |
Scandium(III) triflate | Oakwood Chemical | 009343 | 99% |
Single-use Needle | Exel International | 26420 | 18G x 1 1/2″ |
Sodium azide | Oakwood Chemical | 094448 | 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin. |
Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Powder; Certified ACS |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Pellets; Certified ACS |
Sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | Anhydrous; Granular; Certified ACS |
Syringe Filter 0.45 µm | VWR International | 28145-497 | PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing |
Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T397 | Certified |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) | Oakwood Chemical | 034279 | 98% |
Toluene | Fisher Scientific | T324 | Certified ACS |
Triphenylphosphine | Oakwood Chemical | 037818 | 99% |