Een protocol wordt gepresenteerd voor de synthese van informatie-gecodeerde peptoid oligomeren en voor de sequentie-gerichte zelfassemblage van deze peptoids in moleculaire ladders met behulp van amines en aldehyden als dynamische covalente reactant paren en Lewis zure zeldzame aarde metalen triflates als multi-role reagentia.
Dit protocol presenteert het gebruik van Lewis zure multi-role reagentia om kinetische vangst waargenomen tijdens de zelfassemblage van informatie-gecodeerde oligomrische strengen bemiddeld door gepaarde dynamische covalente interacties op een manier nabootsen van de thermische fietsen vaak gebruikt voor de zelfassemblage van complementaire nucleïnezuur sequenties. Primaire amine monomeren met aldehyde en amine hanger moieties zijn gefunctionaliseerd met orthogonale beschermende groepen voor gebruik als dynamische covalente reactant paren. Met behulp van een gemodificeerde geautomatiseerde peptide synthesizer, de primaire amine monomeren zijn gecodeerd in oligo (peptoid) strengen door middel van solid-phase submonomeer synthese. Bij zuivering door high-performance vloeibare chromatografie (HPLC) en karakterisering door elektrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS), sequentie-specifieke oligomeren worden onderworpen aan hoge belasting van een Lewis zure zeldzame aarde metalen triflate die beide de beschermt de aldehyde moieties en beïnvloedt de reactante paar evenwicht zodanig dat strengen volledig scheiden. Vervolgens wordt een fractie van het Lewis-zuur geëxtraheerd, waardoor het gloeien van complementaire sequentiespecifieke strengen informatiegecodeerde moleculaire ladders kan vormen die worden gekenmerkt door matrixondersteunde laserdesorptie/ionisatiemassaspectrometrie (MALDI-MS). De eenvoudige procedure die in dit rapport wordt beschreven, omzeilt kinetische vallen die vaak worden ervaren op het gebied van dynamische covalente assemblage en dient als platform voor het toekomstige ontwerp van robuuste, complexe architecturen.
Vooruitgang in zelfassemblage, het proces waarbij kleine sub-eenheden grotere architecturen genereren door middel van thermodynamisch gestuurde trajecten, heeft een betere controle over macro- en supramoleculaire nanostructuren geboden, meestal door gebruik te maken van intermoleculaire interacties zoals π-stacking en waterstofbinding1,2,3,4. In het bijzonder zijn nucleïnezuren (d.w.z. polynucleotiden) naar voren gekomen als opmerkelijk veelzijdige nanoconstructiemedia, omdat de hoge informatiedichtheid van de basiskoppeling van Watson-Crick de assemblage van complexe, sequentieselectieve structuren4,5mogelijk maakt. Terwijl de inherent lage sterkte van deze voorbijgaande intermoleculaire bindingen sub-unit herschikking en foutcorrectie mogelijk maakt , zijn de resulterende structuren vaak gevoelig voor thermische en mechanische afbraak6. Dynamische covalente interacties7,8,9, een klasse van covalente hechtingsvormende reacties die omkeerbaar of herschikbaar zijn onder milde omstandigheden en onlangs zijn gebruikt om ingewikkelde macromoleculen zoals ladders10,11,12,13, kooien14,15,16, en stapels17opleveren, verhoogde obligatiesterke punten en robuuste structuren. Helaas wordt de capaciteit voor herschikking en foutcontrole verminderd door de relatief lage herschikkingspercentages van deze covalente soorten, waardoor hun capaciteit voor zelfassemblage in de gewenste producten wordt ingeperkt18. Om deze kinetische overvulling aan te pakken, worden katalysatoren of barre reactieomstandigheden vaak gebruikt in combinatie met eenvoudige bouwstenen. Hier rapporteren we een proces dat kinetische overvulling omzeilt om de zelfassemblage van moleculaire ladders van sequentiespecifieke oligomeren mogelijk te maken, waarbij de hybridisatie wordt geleid door de informatie gecodeerd in de oligomerresidusequenties.
Gezien hun synthetische toegankelijkheid worden poly(N-vervangende glycine)s (d.w.z. peptoids) gebruikt als oligomeric precursoren waaruit de moleculaire ladders zijn geassembleerd19. Peptoids zijn structurele isomers van peptiden waarin hanggroepen worden aangebracht op de backbone-gedragen stikstof in plaats van gekoppeld aan de α-koolstof20. Met behulp van solid-phase synthese, exacte plaatsing van dynamische covalente hanger groepen langs de peptoid keten is gemakkelijk bereikt, waardoor het ontwerp van voorloper oligomeren die kunnen monteren in complexe supramoleculaire structuren21.
De dynamische covalente herschikking van imine connectiviteit wordt gebruikt in deze procedure als de imine-genererende condensatie reactie biedt een handig middel om de zelfassemblage te karakteriseren door massaspectrometrie als elke band gevormd resulteert in een massareductie van 18 g/mol22. Bovendien kan het evenwicht tussen de amine en aldehydereactanten en imineproduct worden gevarieerd door de zuurconcentratie te veranderen. Met name worden metaaltriflaten van zeldzame aarde gebruikt om het evenwicht te beïnvloeden en bovendien ethyleenacetaat beschermde aldehyden23,24,25te debeschermen . Om op te merken, scandium triflate wordt al vaak gebruikt op het gebied van dynamische covalente zelfassemblage, met inbegrip van het recente succes in het helpen van de synthese van covalente organische kaders (COFs) bij kamertemperatuur26,27. Bovendien maakt de contrasterende oplosbaarheid van de oligo(peptoid) sequenties en de zeldzame metalen triflate evenwichtsbeheersing mogelijk door vloeistof-vloeibare extractie. Het gerapporteerde proces maakt gebruik van deze controle om de kinetische barrières te omzeilen die informatiegestuurde zelfassemblage verhinderen.
De techniek hierin beschrijft de dynamische covalente assemblage van informatiedragende peptoid oligomeren, waar informatie wordt gecodeerd in de volgorde van hun hangergroepen. Het gebruik van een alloc-beschermde aminemonomeer in combinatie met een ethyleenacetaal beschermde aldehydemonomeer maakt orthogonale debescherming mogelijk, waardoor Alloc-deprotection op kraal- en acetale deprotection ter plaatse tijdens de zelfassemblagereactie mogelijk is, waardoor de gesynthetiseerde sequenties niet voortijdig reageren vóór oligomerzuivering en karakterisering. Belangrijk is dat de solid-fase synthese wordt uitgevoerd met behulp van een fotolabile hars om oligomer decolleté van de kraal onder UV- of violetlichtbestraling mogelijk te maken, waardoor vroegtijdige debescherming van de zuur-labiele, ethyleenacetaalgebaseerde beschermende groep wordt uitgesloten. Verschillende alternatieve debeschermingsregelingen kunnen worden overwogen. Zo maakten we in eerste instantie gebruik van dual acid-labile protecting groups (Boc-amine en ethyleen acetal-aldehyde) met de bedoeling om in situ deprotection door een sterk zuur gevolgd met neutralisatie om de zelfassemblagereactie door te laten gaan; deze aanpak resulteerde echter in de onmiddellijke generatie van neerslag bij toevoeging van de basis. Als alternatief werd de bescherming van de amine met een fotolabile protecting groep, 2-(2-nitrofenyl)propoxycarbonyl (NPPOC), voor ogen als de aldehyde selectief kon worden beschermd bij behandeling met trifluoroacezuur (TFA) voorafgaand aan de zuivering. Helaas, in situ fotolyse van de beschermende groep met UV-licht niet veroorloven kwantitatieve debescherming, zelfs in aanwezigheid van fotosensibilisaat en na langdurige bestralingsperiode25. Trimethylsilylethoxycarbonyl (d.w.z. Teoc) kan worden gebruikt als een aminebeschermende groep en is onderworpen aan decolleté bij behandeling met metaaltriflaten van zeldzame aarde; kwantitatieve Teoc-deprotection vereist echter veel hogere polyflatebelastingen van zeldzame aardmetalen dan nodig is voor de bescherming van het acetaat van ethyleen. Voor dit protocol mogen Teoc-amines worden gebruikt, maar de lewiszuurconcentratie moet dienovereenkomstig worden aangepast, aangezien subkwantitatieve aminedeprotection problematisch zou kunnen blijken voor grotere zelfgeassembleerde structuren. Aliphatic functionele groepen werden kort overwogen, maar debescherming van aliphatic aldehyden vereist strenge voorwaarden die peptoid opeenvolgingen32,33afkappen.
Integratie van Neee en Nma als inerte spacer residuen dienen om de oplosbaarheid van oligomeer te verbeteren en facile mass-tagging van de voorloper oligomeren in staat stellen zich een gedeready identificatie van de gegenereerde soorten door massaspectroscopie veroorloven. Bovendien, gezien de “Σ-streng” conformatie van peptoids waar aangrenzende ruggengraat segmenten nemen tegengestelde rotatietoestanden om een lineaire, twist-free oligomer34,35vormen , sequenties waarin afwisselend dynamische covalent en inerte afstandsmateriaal residuen vergemakkelijkt een structuur waarin reactieve hanger groepen zijn gericht in dezelfde richting. Gezien de veelzijdigheid van de submonomeermethode kan een grote en diverse bibliotheek van primaire amines worden gebruikt om de peptoid oligomeren verder te wijzigen, maar kan aanpassingen van het protocol vereisen om een hoge koppelingsefficiëntie te behouden.
Terwijl oligo(peptoids) handmatig kan worden gesynthetiseerd in een glazen reactievat19, verkort de automatisering van het proces de tijd voor elke residutoevoeging van enkele uren tot een half uur. Bovendien vermindert automatisering de hoeveelheid monomeer en wasoplosmiddelafval, met name wenselijk bij het gebruik van primaire aminemonomeren die niet commercieel beschikbaar zijn. Hoewel Alloc decolleté van de beschermde amine residuen is een efficiënte reactie, palladium oxidatie kan resulteren in onvolledige deprotection. Bijgevolg wordt voorgesteld om een deel van de hars te testen en de omvang van de bescherming met ESI-MS te karakteriseren. Voor testdecolletés geeft 30 min onder 405 nm bestraling voldoende peptoid vrij voor massaspectrometrie. Gedeeltelijke debescherming kan worden beperkt met het gebruik van anaerobe aandoeningen of het herhalen van de deprotection reactie.
Terwijl dit artikel zich richt op Sc(OTf)3 als een multi-role reagens, andere zeldzame aarde metalen triflates, zoals ytterbium triflate, is aangetoond dat met succes bemiddelen de informatie-gerichte assemblage van moleculaire ladders. Met name Sc(OTf)3 is de meest Lewis zuur van de zeldzame aarde metalen triflates; Door het verminderde katalytische vermogen van andere metaaltriflaten van zeldzame aarde24,36, kunnen dus grotere equivalenten nodig zijn om volledige ethyleenacetale deprotection en stranddissociatie te bewerkstelligen. Het aantal vereiste equivalenten kan met MALDI-massaspectrometrie worden bepaald door het punt waar strengen volledig loskomen te observeren. Dissociatie is van cruciaal belang in het zelfassemblageproces en is analoog aan het smelten van nucleïnezuurstrengen bij verhoogde temperatuur. De daaropvolgende extractie van katalysator maakt de vorming en verstoring van dynamische covalente combinaties die de assemblage van sequentie-specifieke duplexen. Deze geleidelijke annealing van de oligomeric strengen omzeilt de kinetische vangst (die voor moleculaire ladders, buiten registersoorten of verkeerd paarsequenties) kan opleveren die door andere methodes worden ervaren.
Chloroform is een uitstekend oplosmiddel als fasescheiding in de chloroform / acetonitril/water ternaire systeem hier gebruikt bevordert de gedeeltelijke extractie van Lewis zuur zonder dat resulteert in neerslag van zelfgemonteerde structuren37. Bovendien, chloroform is een van de weinige oplosmiddelen die imine vorming bevordert met behoud van moleculaire ladder oplosbaarheid. Sporen van out-of-registry en verkeerd gekoppelde duplexen kunnen vaak worden waargenomen vanwege de dynamische aard van het systeem. Hoewel dit systeem grotendeels wordt beïnvloed door kleine variatie in de concentraties van zeldzame metalen triflate bij extractie, genereert onvoldoende katalysatorextractie soms een aanzienlijk deel van onvolledige hybridisatie en niet-specifieke oligomeerkoppelingen. In dit geval is het over het algemeen beter om eerst opnieuw te scheiden met nog eens 1,5 equivalenten katalysator en vervolgens een tweede keer te extraheren in plaats van onmiddellijk opnieuw te extraheren, omdat de volledige dissociatie van enkele strengen van vitaal belang is voor het proces. Om tegelijkertijd verschillende unieke informatiegecodeerde moleculaire ladders te monteren, kan het nodig zijn om de concentratie van de zeldzame metalen triflatestockoplossing die wordt gebruikt om equivalenten en het totale reactievolume te behouden, te verhogen.
Hoewel deze zelfassemblages voornamelijk worden gekenmerkt door massaspectrometrie, zijn andere technieken, waaronder fluorescentieresonantieenergieoverdracht (FRET) mogelijk. Beperkingen omvatten de hoeveelheid materiaal die nodig is, betaalbaarheid van monomeren en signaal-ruisverhouding. Technieken die oplosmiddelen vereisen, zoals 1H NMR, kunnen bovendien lijden onder de onoplosbaarheid van zelfgeassembleerde structuren. Bovendien kunnen de concentraties van metaaltriflate van zeldzame aardnat na extractie worden bepaald door middel van methoden als ICP-MS of 19F NMR met een interne standaard.
Naarmate de vooruitgang in de richting van een betere controle op macro- en supramoleculaire nanostructuren en materialen vordert, ontstaat de uitdaging om regelmatige, maar aanpasbare samenstellingen te ontwerpen en te fabriceren. Het in dit verslag beschreven protocol biedt een pad om dergelijke nanostructuren te bereiken door middel van sequentieselectieve samenstellingen via dynamische covalente interacties.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse Ministerie van Energie, Office of Science, Basic Energy Sciences, onder Award #DESC0012479. S.C.L. erkent de steun van het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program en A.F.A. erkent de steun van Abu Dhabi National Oil Company (ADNOC).
1,4-Dioxane | Fisher Scientific | D1114 | Certified ACS |
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) | Millipore-Sigma | 54793 | Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5% |
4-(2-Aminoethyl)aniline | Ontario Chemicals | A2076 | 98% |
4-Cyanobenzaldehyde | Oakwood Chemical | 049317 | 99% |
4-Methylpiperidine | TCI America | P0445 | ≥98.0% |
4-Toluenesulfonyl chloride | Oakwood Chemical | BR1703 | 99% |
50 mL High Performance Centrifuge Tubes | VWR International | 21008-240 | Centrifuge Tubes used for automated synthesizer |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Glacial |
Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10 | Certified ACS |
Acetonitrile | Millipore-Sigma | 34851 | For HPLC; Gradient grade; ≥99.9% |
All-plastic Norm-Ject syringes | Thermo Fisher Scientific | S7510-10 | Luer-Slip Syringe |
Allyl chloroformate | Acros Organics | 221741000 | 97% |
Bromoacetic acid | Alfa Aesar | A14403 | ≥98.0% |
Chloroform | Millipore-Sigma | 288306 | Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
Chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules |
Dichlorodimethylsilane | Acros Organics | 1133100 | ≥99.0% |
Dichloroethane | Fisher Scientific | E175 | Certified ACS |
Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | Stabalized; Certified ACS |
Diethyl ether | Acros Organics | 615080010 | Anhydrous; ACS reagent |
Diethylene glycol monoethyl ether | TCI America | E0048 | ≥99.0% |
Ethanol | Decon Labs | 2701 | 200 Proof; Anhydrous |
Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178 | Certified |
Fmoc-Photolabile SS resin | CreoSalus | SA50785 | 100-200 mesh; 1% DVB |
Glass Peptide Vessel | Chemglass | CG-1866-02 | Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread |
LC-6AD HPLC pumps | Shimadzu Corporation | Equipment | |
LED 405nm | ThorLabs | M405L2-C1 | 405 nm LED used for photocleavage of peptoid |
LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | Driver for LED light used in photocleavage of peptoid |
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer | CEM Corporation | Equipment | |
Lithium aluminum hydride | Millipore-Sigma | 199877 | Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture |
Luna C18 analytical RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4252-E0 | Equipment |
Luna C18 prepatory RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4253-P0-AX | Equipment |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | Certified ACS |
Microliter Syringe | Hamilton Company | 80700 | Cemented Needle (N) |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | Oakwood Chemical | M02889 | ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization |
N,N-Dimethylformamide | Millipore-Sigma | 319937 | ACS reagent; ≥99.8% |
Nitric acid | Fisher Scientific | A200-212 | Certified ACS Plus |
Nitrogen gas | Cryogenic Gases | Contents under pressure, may explode if heated | |
Phenylsilane | Oakwood Chemical | S13600 | 97% |
Prominence SPD-10A UV/vis Detector | Shimadzu Corporation | Equipment | |
p-Toluenesulfonic acid monohydrate | Millipore-Sigma | 402885 | ACS reagent; ≥98.5% |
Scandium(III) triflate | Oakwood Chemical | 009343 | 99% |
Single-use Needle | Exel International | 26420 | 18G x 1 1/2″ |
Sodium azide | Oakwood Chemical | 094448 | 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin. |
Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Powder; Certified ACS |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Pellets; Certified ACS |
Sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | Anhydrous; Granular; Certified ACS |
Syringe Filter 0.45 µm | VWR International | 28145-497 | PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing |
Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T397 | Certified |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) | Oakwood Chemical | 034279 | 98% |
Toluene | Fisher Scientific | T324 | Certified ACS |
Triphenylphosphine | Oakwood Chemical | 037818 | 99% |