用于大规模核相互作用分析的无标签免疫沉淀质谱工作流程

注：表1概述了所有缓冲成分和蛋白酶混合物。 1. 细胞的制备 注：这种免疫沉淀质谱（IP-MS）方法需要每复制1~10毫克核莱沙的起始材料。在三联和三联控制中，1mg的核免疫沉淀将给予细胞量。 如果使用粘附细胞系，在收获前，每次复制3 x 15厘米的培养皿中，将细胞生长到90%的汇合度。注：建议对诱饵和控制条件至少执行三个复制免疫沉淀。该协议将假定使用”仅珠子”控件，该控件控制与珠子的大量非特定交互，从第 4 节开始。其他类型的控件可能很有用。讨论部分对此进行了深入描述。 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤板2x，使用每15厘米板使用3mL0.25%的胰蛋白酶来胰蛋白化细胞。在1，200 x g下旋转细胞5分钟，并去皮素。 对于悬浮细胞，生长到类似的规模/密度，以达到70-80毫克的总蛋白质。 在1，200 x g和4°C下粒细胞5分钟。小心地将介质分给。注：在此步骤中可以组合小球，以便使用第 2 节中概述的大规模亚细胞分馏实现高效处理。 用PBS + 5 mM MgCl2补充蛋白酶抑制剂（PIs）和磷酸酶抑制剂（PhIs）洗涤细胞颗粒2x（见表1）。注：细胞颗粒可闪冻结在液氮中，并储存在-80°C，直到准备分馏。 2. 核提取物的制备 注：蛋白酶和磷酸酶抑制剂应在使用后30分钟内添加到分馏缓冲液中。 如果冷冻，在冷缓冲液 A + PI/PhIs 的 1x 颗粒体积中解冻细胞颗粒 15 分钟。将细胞颗粒放在4°C的螺母上，以帮助解冻时重新悬浮。否则，将细胞颗粒从步骤 1.3 重新悬浮到 1x 颗粒体积缓冲 A + API /PHI。 在2，000 x g和4°C下颗粒10分钟，使缓冲液分光。 用缓冲器 A 将包装的细胞体积的 5 倍悬浮细胞，并在冰上孵育 20 分钟。 在 2，000 x g和 4 °C 下，将缓冲液分10分钟，用2倍原装包装细胞体积缓冲器A+PI/PHIs重新悬浮，用”A”/松软的虫刺片进行7倍的悬浮。 在 2，000 x g和 4 °C 下使莱酸离心 10 分钟。 小心地移掉上清液，用液氮闪光冻结。将分乳酸储存在-80°C。此步骤的上清液是细胞亚细胞分数。注：在此步骤中，通过用液氮闪光冷冻并储存在-80°C，可以节省核颗粒 用 0.9x 缓冲液 B + PI/ PhI 的颗粒重新悬浮颗粒，并在 4°C 下在螺母上混合 5 分钟。 要使核被分出，用更紧的”B”发出20倍的刺。 在4°C下将核分糖在螺母上混合30分钟，使其均匀。 在4°C下在21，000 x g下将核莱沙离心30分钟。移液关闭上清液，并保存为可溶性核蛋白提取物。注：核酸酶处理产生的核颗粒允许恢复染色质相关的蛋白质部分。 在4°C下，将可溶性核提取物与缓冲C+PI进行3小时透析。 切割适当长度为 24 mm 宽度的透析管，切断 8 kDa 分子量。夹紧管的一侧，将核质加载到管中。装载液化液后，夹住另一端，然后浸入含有缓冲 C + API 的清洁玻璃容器中。 在4°C下将直径核提取物/核质在21，000 x g下离心30分钟。用于 IP-MS 分析的核提取物可以在液氮中进行无用和闪光冷冻，如果需要，可储存在-80°C。 3. 亚细胞分馏的验证 完成蛋白质测定以确定核莱沙酸的蛋白质浓度。双辛酸蛋白测定为下游应用提供了足够的灵敏度。 如前所述，在SDS-PAGE凝胶上加载20μg的细胞和核馏分，用于西方斑点分析。加载时跳过通道，以避免样品的特性错误。 探测西方污点p84（THOC1）作为核标记，和GAPDH作为细胞体标记。根据核分数中的细胞标记的比例确定分馏范围，反之亦然。注：可以使用其他核和细胞标记的抗体。 4. 内源核饵蛋白的免疫沉淀 注： 建议从此时起使用低固定管。这将减少在样品处理过程中对管的非特异性结合，并避免不必要的样品损失。此外，确保 LCMS H2O 级用于为其余步骤准备缓冲区。 在微离心管中结合蛋白质-A和蛋白-G的12.5 μL珠体积，为每个复制制备蛋白质A/G珠混合物。将珠子储存为含有 20% 乙醇的浆料。使用在吸头上切开的移液器尖端确定浆料 %（v/v） 内的珠子浓度，并使用移液器吸头移液器，以确保珠子可以进入吸头。 用300μL的IP缓冲液1清洗蛋白质A/G珠混合物2x。在 4°C 下以 1，500 x g旋转珠子 1 分钟，并旋转缓冲液。 制备抗体蛋白A/G珠子：要将抗体与珠子结合，请加入300μL的IP缓冲液1和10μg所需的抗体。让珠子/抗体混合物在4°C的螺母上过夜。对于仅珠控制，不要添加任何抗体。注：每个复制总共10μg的抗体可以用作起点，但需要针对每个单独的抗体和实验中使用的解毒物的尺度进行精确优化 在水浴中将步骤2.10中的核液解冻，并将适当的体积与低保留微离心管中解冻，每次复制1mg蛋白质输入。 以16，000 x g旋转16，000 x g30分钟，并将上清液转移到新管中。 每1mg的核莱糖和在4°C的螺母上加入1μL的苯甲酸酶（250单位/μL），10~15分钟。 准备珠子，以预清除乳清。如步骤 4.1 中，将每个蛋白质 A 和蛋白质 G 珠的 12.5 μL 添加到 1.5 mL 低保留管中。用 IP 洗涤缓冲液 1 + API 清洗 2 次，并清除缓冲液。 从步骤4.5向珠子中加入1毫克的核莱沙。在 4°C 下在螺母上摇动 1 小时时孵育。 离心预清除在1，500 x g和4°C1分钟。 当核解液在步骤 4.5.1 中用珠子孵育时，用 IP 缓冲液 1 + PI 清洗抗体蛋白 A/G 珠 2x。在1，500 x g和4°C下离心1分钟，并去向缓冲液。 将预清除的核解结物从步骤4.6.1转移到抗体蛋白A/G珠子上。在4°C下摇动螺母时孵育4小时，在1，500 x g和4°C孵育1分钟后，离心。 将上清液转移到标记为每个复制的流通过管中。 用 1 mL 的 IP 缓冲液 2 + PI 清洗抗体蛋白 A/G 珠子。在1，500 x g和4°C下离心1分钟，去皮缓冲液，并重复共3倍。 与上一步一样，用 1 mL 的 IP 缓冲液 1+ PI 离心清洗珠子 2x。确保上次洗涤后清除所有缓冲液。 20 μL 的 2x 甘氨酸 （pH 2.75）， 每次 30 分钟。使用洗脱缓冲液确保管在孵育过程中摇动。在750 x g和4°C下旋转1分钟，每孵育30分钟后移液器离开上清液。注：虽然此处描述的低pH甘氨酸方法使大多数诱饵蛋白洗脱，但一些抗体-抗原相互作用需要更严格的缓冲条件。 闪速冷冻在液氮中，储存在-80°C。 5. 样品制备 注：胰岛素插入免疫沉淀洗脱样品有助于在三氯乙酸（TCA）沉淀和样品处理期间恢复蛋白质，这对低丰度内源诱饵蛋白非常重要。 如果冷冻，在室温下解冻。 将样品放在冰上，每100μL的渗脂中加入10μL的1.0mg/mL胰岛素。涡旋，然后立即加入10μL的1%脱氧胆酸钠。再次涡旋样品，加入30μL的20%TCA，然后加入一个最终的涡旋。 在冰上孵育样品20分钟，然后在4°C下以21，000 x g离心30分钟。 吸出上清液，并加入0.5 mL的丙酮，丙酮已预冷却至-20°C。涡旋，然后在21，000 x g和4°C旋转30分钟。 吸气上清液，使留在管底部的颗粒干燥。 使用经过改进的过滤器辅助样品制备 （FASP） 方法准备质谱样本，该方法经过优化，可减少样品处理，如下所示14。 用30 μL的SDS烷基化缓冲液从步骤5.1.4中重新悬浮蛋白质颗粒（见表1）。在 95°C 热块上孵育样品 5 分钟。在进行下一步之前，在室温下冷却 15 分钟。 在每个样品中加入 300 μL 的 UA 溶液和 30 μL 的 100 mM TCEP。将此解决方案加载到 30k 离心滤波器上。在室温下以 21，000 x g旋转离心滤波器 10 分钟。注：诱饵蛋白及其假定的相互作用者此时应绑定到过滤器。但是，如果过滤器出现问题，可以保留流。 用 250 μL UA 清洗过滤器，以 21，000 x g的离心机清洗 10 分钟。 用 100 mM Tris pH 8.5 的 100 μL 清洗过滤器，在 21，000 x g下将离心机清洗 10 分钟。 加入 3 μL 的 1 μg/μL Lys C 重新悬浮在 0.1 M Tris pH 8.5 中。将过滤器填充至 100 μL 标记，并在 37°C 下消化 1 小时，同时在螺母上摇动。 加入1 μL 1μg/μL MS级胰蛋白酶。轻轻混合，让胰蛋白酶在37°C下与样品一起孵育过夜，同时在螺母上摇动。 在 21，000 x g下离心 20 分钟，从过滤器中排出肽。注：可能需要多轮离心才能恢复所有埃卢特。如果这样做，有严重样品损失的可能性。 使用 C18 旋转柱对肽进行脱盐。遵循制造商提供的协议。 在7μL0.1%TFA中重新悬浮冻干肽，在5%醋酸酯中。将样品松点3分钟，以确保肽已被重新悬浮。以 14，000 x g下旋转 10 分钟。 将重新悬浮的肽转移到适当的样品小瓶中，以装载到液相色谱-质谱（LC/MS）系统中。 6. LC/MS 系统适用性 注：由于亲和纯化样品中蛋白质的量度较小，且一般含量较低，LC/MS 平台以最大的灵敏度和鲁棒性运行至关重要。 在移动A阶段将1mLLC/MS级酸添加到1L的LC/MS级水中，并将1mLLC/MS级酸添加到1升LC/MS级乙酰乙酰乙酸。 准备或安装 75 μm 熔融硅毛细管柱，内装 <2 μm 反向相 C18 树脂，长度为 ±250 mm。将样品直接注入列中，将获得最佳效果。 使用全新的移动相位清除超高性能液色谱 （UPLC） 系统。安装 C18 柱后，使用合适的发射器（即 20 μm id x 360 μm od 拉到 10 μm 尖端）建立稳定的流速和电喷。将柱保持在 40°C。C。 通过注入复杂的质量控制标准（如 HeLa 全细胞溶酶胰子板消化的 100–200ng），测试整体 LC/MS 系统性能。具有适合复杂样本的渐变（即 2⁄3 小时梯度洗脱时间）。建立肽和蛋白质鉴定的基线系统性能。注：为获得最佳效果，从 20，000-35，000 种独特肽中进行 3，000~5，000 或更多蛋白质鉴定，将为实验样品提供最佳性能。 对于常规LC/MS系统的适用性，注射100~200 fmol或更少的单一蛋白质消化标准，如牛血清白蛋白（BSA）。具有短梯度（即 20-30 分钟）的空值。注：多次注射蛋白质消化液将有助于建立基线LC/MS系统性能，每个IP-MS样品在每次IP-MS样品后重复注射，提供整个实验系统性能的测量，并允许检测仪器漂移，这可以偏置无标签实验。选定单个峰值强度和峰值形状的基线将通知 MS、LC 和列的性能。 为避免分析柱过载，将实验样品的一小部分（占总数的 15-30%）加载到基柱上，并使用适用于复杂样品的梯度（即 2⁄3 小时）进行分离。如果蛋白质鉴定的数量不能令人满意，则将所有样品加载到柱上。 在样品之间运行单一蛋白质消化标准，以监测LC/MS系统性能和样品结转。根据您的样品，可能需要多个标准来减少样品结转。 7. 数据处理 下载在https://www.maxquant.org/找到的蛋白质组学软件包 MaxQuant。注： 这将用于将步骤 6.6 中的 RAW MS 数据文件处理到蛋白质 ID、基因名称和定量值的数据表中，这些值与用于下游分析的标识相关联。 选择”原始数据”选项卡的”输入数据”子标题中的”加载”。打开存储 MS 原始文件的文件位置，并为每个 MS/MS 运行选择原始文件。 单击”特定于组”选项卡并选择”消化”。在酶列表中选择LysC并单击右箭头将此酶添加到将在搜索中使用的列表中。接下来，选择”乐器”并确保屏幕顶部的下拉列表中显示正确的仪器类型。将其他特定于组的搜索参数保留在标准设置上。 单击”全局参数”选项卡并选择”序列”。为将在此搜索中使用的分类添加相应的 FASTA 文件。如果不这样做，将不能正确分配肽。对于人类蛋白酶，从UniProthttps://www.uniprot.org/help/human_proteome下载FASTA文件。 在”全局参数”选项卡中，单击蛋白质量化。在”肽量化”下拉菜单中，选择”唯一+ 剃刀”。注：MaxQuant通过基于强度的绝对定量（iBAQ）和无标签定量（LFQ）提供蛋白质的替代定量。然而，肽计数信息足以进行本协议15中的下游分析。 在 MaxQuant 接口的左下角，选择要用于搜索的处理器数。这将直接影响运行所需的时间长度，因此请为此选择尽可能多的时间）。单击屏幕左下角的”开始”以开始运行。选择屏幕顶部的”性能”选项卡以查看搜索进度。 运行完成后，打开Perseus中的蛋白质组.txt文件，一个蛋白质组学计算平台，或其他电子表格程序来查看数据16。 使用 Perseus 去除常见污染物，并击中反向蛋白质序列。按照http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions的详细珀塞斯文档进行操作。注：在分析软件（例如Excel）中打开蛋白组.txt文件将自动损坏某些基因和蛋白质名称。 使用相关性净化污染物库 （CRAPome） 分析实验数据。http://crapome.org/在此存储库中注册一个帐户，并根据需要按照本教程进行操作17、18。 使用在 CRAPome 主页上找到的”分析数据”工作流。选择对应于此交互实验中使用的亲和纯化系统的外部控件。注：这些控制可用于计算可用于检测常见污染物的第二次折数变化浓缩。 使用 Perseus 或合适的电子表格应用程序从 MaxQuant 的蛋白组.txt 输出生成输入文件。有关手动格式化的详细信息，请参阅http://crapome.org/?q=fileformatting。或者，使用提供的 R 脚本”export_CRAPomeSAINT_Input_File.R”生成 SAINT/CRAPome 输入文件。请参阅补充编码文件中的 README.txt 。 运行分析，以确定免疫沉淀中每个诱饵蛋白的折叠变化浓缩和SAINT（INTeractome显著性分析）概率。确保在 FC-A 下的下拉菜单中选择”用户控件”，在FC-B下拉列表中选择”CRAPome 控件”或”所有控件”，并选择概率分数以生成 SAINT 概率。运行结束后，查看”分析结果”下的可用输出以及作业 ID。从”分析结果”下载数据矩阵，以便将来绘图和数据可视化。 通过遵循补充编码文件中提供的R-Scripts，将蛋白质作为FC-A（IP与用户控制）和SAINT概率的函数进行绘制。注： 提供一组 R 脚本，用于生成 FC-A vs. SAINT 概率和 iBAQ vs. log2（蛋白质丰度）的绘图，由从无标签强度的经验 Bayes 分析的调整后的 p 值范围着色。差分统计分析和绘图的详细信息在 README.txt 和 R 脚本”main_differential_analysis中找到。R”在补充编码文件中。 评估诱饵蛋白的已知相互作用蛋白按 FC-A 和 SAINT 排列的位置。在三脚架上进行单诱饵实验，截断 FC-A > 3.00 和 SAINT > 0.7 作为起点。注：选择”高置信度”交互和”低置信度”交互器的截止点时，必须根据生物信息进行通知。 8. 数据可视化 注： 有许多程序可以有效地可视化蛋白质组数据（例如，R、Perseus、Cytoscape、STRING-DB）。分析高置信度命中与这些交互器的功能丰富之间的连接性，对于确定命中优先级以便进一步验证和功能表征，可能是一个有用的策略。 下载Cytoscape，一个开源网络可视化工具https://cytoscape.org/download.html19。 准备一个输入文件，作为一个选项卡分隔文件格式化与三列：诱饵（源节点），猎物（目标节点），交互类型（边缘类型）。这可以在 Perseus 或任何您选择的电子表格程序中完成。 从文件图标选择”导入表”，朝向程序左上角（由向下箭头和图标中的矩阵指定）。Cytoscape 将自动将交互数据填充到网络中，以便进行自定义格式设置和设计。 选择 Cytoscape 控制面板上的”样式”选项卡，然后单击”Def”列中的方块以调整整个网络的属性。选择网络中的特定节点或边，然后选择样式菜单的Byp.列中的正方形以绕过默认设置并仅调整选定对象。或者，单击样式菜单顶部的下拉菜单以查看预设的网络格式。注：STRING-db蛋白-蛋白质相互作用数据此时可以手动通过输入文件或通过Cytoscape中的插件的各种扩充工具集成到该网络中，http://apps.cytoscape.org/20。推荐用于浓缩分析的细胞景插件在21http://apps.cytoscape.org/apps/cluego。 要增加对在此工作流中生成的数据集的信心，应执行以感兴趣的猎物蛋白为目标的对等 IP-MS 或 IP-西方实验。