皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

すべての動物実験は、実験動物のケアと使用のためのガイド(NIH出版第85-23号、改訂2011)および動物福祉に関するポルトガルの法律(DL 129/92、DL 197/96;P 1131/97)。有能な地方自治体は、この実験プロトコルを承認しました (018833). 1. ストック液の調製 (表 1) 表2の指示に従って、心筋細胞の分離(RELAX-ISO)のためのリラックスした溶液の1,000 mLを準備します。上記の試薬を≈500 mLに溶解し、PHをKOHで7.0に調整します。最終ボリュームを1000 mLに調整します。 50 mLチューブにリラックスISOを配る。-20°Cで保管してください。 表 3の指示に従って、250 mL のアクティブ化ソリューションを準備します。上記の試薬を≈100mLの超純水に溶解します。15°Cで5 M KOHでpHを7.1に調整します。注: 通常、所望の pH に到達するためには、大量の KOH を追加する必要があります。体積バルーンを氷付きの箱に入れ、溶液を15°Cに冷却します。 最終ボリュームを250 mLに調整します。リラックスした溶液と混合する瞬間まで、磁気攪拌機で連続的にこの溶液を攪拌します。 表4の指示に従って、リラックスした溶液の100 mLを準備します。上記の試薬を超純水≈50mLに溶解します。15 °CのKOH 5 MでpHを7.1に調整します。注: 通常、7.1 の pH に到達するには、大量の KOH を追加する必要があります。氷で満たされた箱に体積バルーンを入れ、溶液を15°Cに冷却します。 測定中に使用した溶液のイオン強度は180 mMに及んだ。 最終ボリュームを100 mLに調整します。この溶液を活性化溶液と混合する瞬間まで、磁気攪拌機で連続的に撹拌します。 5.0 と 6.0 の間の pCa 溶液を得るために 表 5 で示される比率で活性化および緩和のソリューションを混合します。 常にリラックスして、両方を混合しながら、攪拌ソリューションを活性化し続けます。 アリコート各混合物を2 mLマイクロチューブにする。すべてのマイクロチューブを-20 °Cに保管してください。 プロトコルごとに異なる pCa ソリューション (4.5 ~ 6.0) のバッチを準備します。 2. 力変換器の校正 注: 力トランスデューサのキャリブレーションは、数ヶ月ごとに、または校正が行われないと疑われる場合に実行する必要があるルーチン手順です。力のトランスデューサーは非常に敏感であり、容易に壊れる。キャリブレーション、心筋細胞の接着、洗浄など、その使用のあらゆる段階で穏やかに処理する必要があります。 装置の残りの部分から力のトランスデューサーを取り外します。 クランプの助けを借りて、針が心筋細胞が力を発達させるのと同じ方向に下向きになるように、力トランスデューサを水平に置きます。これは、既知の重み(弾性バンド、縫合またはピン)を持つ一連の質量を吊り下げやすくします。注:このステップに進む前に力変換器の特性を確認して、スケールファクター[mg/volt]をチェックし、トランスデューサの過度の重量を避けてください。力トランスデューサモデルの場合、スケール係数は50(50mgは1ボルトに相当)であり、12.5〜250mgの間で5つの重みを使用します。 力のトランスデューサーをオンにし、30分間ウォームアップします。 まず、フォーストランスデューサに軽い質量を掛け、FORCE OUTで測定された対応する電圧を登録します。 最大 5 つのウェイトに対してこの手順を繰り返します。 力トランスデューサ(負荷)対電圧に適用されるプロット力と直線性のチェック。 直線性がない場合は、トランスデューサの回路基板のゼロとゲインポテンショメータを調整します。詳細については、その特定の命令を確認してください。 出力電圧が0.0Vになるまでゼロポテンショメータを回します。 トランスデューサ針に中程度の重量を渡し、ゲインポテンショメータを調整して対応する電圧を読み取ります(例えば、50 mgは1Vに対応)。重量を取り除き、ゼロポテンショメータを0.0に再調整します。 重み付きと重量なしの出力が正しくなるまで、ステップ 2.6.2 を繰り返します。 フォーストランスデューサを装置に取り付け直します。 3. 実験装置の設定 活性化、4.5、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0の各バイアルを解凍し、リラックスしたソリューションを氷の上に維持します。注: ATP および PCr は、寒い温度で維持する必要がある不安定な化合物です。 顕微鏡、試験装置、関連するコンピュータを使用できるように準備します(図1)。 室内温度計が15°Cを読み取るように温度を調整します。 キナーゼおよびホスファターゼインキュベーション(20°C)を除くすべての実験をこの温度で行います。 フォーストランスデューサとモーターをオンにします。 4. 皮膚心筋細胞の抽出と透過 リラックス-ISO溶液の50 mLを解凍します。 遠心分離機をオンにし、4°Cまで速く冷却します。 2.5 mLのRELAX-ISO溶液を含むペトリ皿の心筋サンプルの3〜5 μgを解凍します。 メスの刃でティッシュを小さく切る(図2)。不必要な細胞の損傷を避けるために正確な方法でサンプルをカットします。 切断されたピペットチップを使用して、組織とのリラックス-ISO溶液の2.5 mLをポッター・エルヴェイェムガラスに移します。 機械的に30〜40 rpmの回転速度でグラインダーで組織を破壊する。組織をそれぞれ2回押し、良好な細胞懸濁液を得た。 15 mLチューブに、リラックスISO溶液(2.25 mLのリラックス-ISOを有するトリトン250 μL)で10%トリトンを調製し、この溶液を細胞懸濁液に加えます。 管を3回逆にして軽く混ぜます。 氷上で1分4分室温でインキュベートします。 15 mLチューブの上部にRELAX-ISOを追加してトリトンを洗い流します。穏やかに混合(3倍のチューブを反転)し、最後に斜めの遠心分離機で細胞を回転させる(348 x gで1分)。細胞ペレットの上に3 mLまでの上清を取り除きます。注:セルペレットを乱さないように上澄み剤をそっと取り除いてください。それでも、上清の一部の細胞は必然的に失われます。 ステップ4.10を少なくとも4回、またはトリトン残基によって生成された気泡が見られないまで繰り返す。注: 洗い流しの手順が多いほど、廃棄された上清で失われるセルが多くなります。 最後の洗い流しでは、上清を5〜10mLのセル懸濁液の体積まで取り除きます。 5. 皮をむいた心筋細胞の選択と接着 顕微鏡スライドホルダーのガラススライドの上のカバースリップにセルサスペンションドロップを置きます(図1)。 良好な線条パターンとサイズを持つ単一の棒状の心筋細胞を選択します(図2)。 逆顕微鏡の最も低い倍率を使用して、力トランスデューサとモータの針先を見つけます。 カバースリップを回転させて、選択した心筋細胞を水平に配置し、その端点が力変換器とモーターの針に合うようにします(図2)。 綿棒の先端の助けを借りてカバースリップの側面に接着剤の細い線を置く(図2)。 力トランスデューサとモーターの針先を接着剤ラインに浸し、両方の先端の周りに接着剤ハローを作成します。注: ステップ 5.6 から 5.10 はモーター付きマイクロポジショナーの注意深い使用によって達成される。 針先を心筋細胞の焦点面の近くに素早く動かします。 力トランスデューサの針の先端を下に移動して、心筋細胞の1つの端に接着します。 この手順を、モーターの先端とセルのもう一方の端数で繰り返します。注:接着剤が非常に速く治り始めるので、この手順は2〜3分未満でなければなりません。 5~8分後、針を≈15 μm持ち上げて、細胞をカバースリップに接着しないようにします。これは、両方のマイクロマニピュレータを同時に上に移動することによって行われます。 接着剤を治しましょう。この手順は、接着剤の種類に応じて、15〜45分持続することができます。我々の場合、心筋細胞は15分後に十分に接着≈。 6. 能動、受動、Ca2+ 感度の記録力測定 第1実験をリラックスした溶液(実験装置では55-100 μL)、第2の実験井戸を活性化溶液で充満します。 カメラソフトウェアを使用して、関心領域(ROI)を線条の明確なパターンで心筋細胞の領域に配置します。注意:心臓筋細胞の場合、手術サルコメアの長さは1.8~2.2μm、最適サルコメア長は約2.15μmです。 最適なサルコメア長さ(2.2 μm)を設定した後、心筋細胞の2つの両極端(モーターからトランスデューサの接着剤ハロー、 図3)の間の距離を測定します。ソフトウェアにミオサイト長として値を記録します。 心筋細胞の幅と深さを測定し、後者は細胞に垂直に置かれたプリズムミラーの助けを借りて。注: プリズムを通してセルを視覚化するには、強力な外部光源が必要になります。プリズムがない場合、心細胞が楕円形であると仮定すると、心筋細胞の深さは心筋細胞の幅の70%と推定することができる。 心筋細胞の楕円形状を仮定して断面積(CSA,mm2)を計算する。 顕微鏡のステージを静かに動かし、細胞がカバースリップからステージ背面のリラックスできる溶液を含むウェルに移動するようにします。メモ:この手順は、簡単にセルを損傷することができます。細胞を動かす前に、針をもう少しゆっくり上に動かします。ソリューションからセルを削除しないようにします。 2つのセル短縮(初期長の80%)を含むソフトウェアでプロトコルを選択し、セルがCa2+ ソリューションとリラックスソリューションで出現したときに発生します(図1、補足ファイル)。注:セルの最初の「Slack」は、活性化ソリューション内で実行され、リラックスしたソリューション内の2番目の「Slack」が実行されます。これにより、ユーザは、2番目からセルの1stと受動力(F受動)からセルの総力(F合計)を計算できるようになります。有効な力を計算するために式を使用して、Fアクティブ= F合計- Fパッシブ。セルは、すべてのクロスブリッジの記録力を取り外すために80%短縮されます。 顕微鏡ステージを動かして、心筋細胞がリラックスした溶液から活性化溶液(pCa=4.5(1))に移動するようにして、等角体収縮を引き出します。メモ: セルが機能している場合は、すぐに縮小します。 力高原に達すると、力データの記録を開始します。注: テストは個別に行うことができます。ソフトウェアによっては、Ca2+感度プロトコル内の異なるCa2+ソリューションに対応する一連のテストを作成する可能性があります(図1、補足ファイル)。 ~10 s待ってから、活性化溶液に浸したセルを切り替えます。注:リラックスした溶液にセルを浸す前に10 s待つことが重要です。セルの移動が早すぎると、セルの再開発力(ktr値)を計算する重要なデータが失われる可能性があります。 心筋細胞がリラックスした溶液に浸るようにステージを素早く動かします。 テストが停止するまで待ちます。 ステップ 6.8 ~ 6.12 を繰り返して、セルが活性化ソリューションで 2 回アクティブになるようにします (pCa=4.5(2))。注:通常、最初の活性化後、心筋細胞の端部は、心筋細胞の長さ、CSAおよび/またはサルコメアの長さを変更し、針の先端からわずかに切り離すことができます。目的のサルコメアの長さに再調整し、ソフトウェアで修正された寸法を導入します。 ステップ 6.13.2 に進む Ca2+ 感度プロトコルの場合、またはデータを保存します(セルの受動力とアクティブな力の値が必要なパラメータが唯一のパラメータである場合は、針からセルを取り外し、アセトンで除去して接着剤を除去します)。 必要に応じて、セルのサルコメアの長さを2.2 μmに調整し、もう一度少し伸ばします。 活性化ソリューションを次のCa2+ ソリューション(ここでは55-100 μL)に置き換えてください。手順 6.8 ~ 6.12 を繰り返します。 活性化ソリューションを次のCa2+ 溶液(ここでは55-100 μL)に置き換え、すべてのソリューションがテストされるまでステップ6.8~6.12を繰り返します(5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0)。 最後に、活性化溶液(pCa4.5(3))でセルを再活性化します。手順 6.8 ~ 6.12 を繰り返します。 キナーゼとホスファターゼを用いてインキュベーション 選択したベースラインプロトコルを実行した後、推奨濃度でリラックス溶液中のキナーゼ/ホスファターゼを希釈します。注:実験の前に線量応答曲線を実行することをお勧めします。 実験井戸の温度を20°Cに設定します。 実験井戸にキナーゼ/ホスファターゼ、リラックスした溶液、活性化溶液(55-100 μL)を充填してください。 顕微鏡を穏やかに動かし、細胞がキナーゼ/ホスファターゼを含むウェルに浸るようにします。 キナーゼ/ホスファターゼを用いて、30分以上かメーカーの指示に従って心筋細胞をインキュベートします。 選択したベースライン・プロトコルを繰り返します。 8. 実験の最終化 細胞を伸ばして力トランスデューサとモーターの先端から心筋細胞を接着解除します。 アセトンに浸した綿棒を使用して、針の先端から接着剤ハローを慎重に取り除きます。 機器をシャットダウンします。 9. データの分析 テストした各心筋細胞からすべてのファイルを収集します。注: 各テストは 1 つのファイルに対応します。これは、Ca2+ 溶液またはサルコメアの長さごとに、対応するファイルがあることを意味します。 単一心筋細胞の活動力と受動力を計算する。 スプレッドシートを使用して最初のアクティベーション(pCa=4.5(1)))に対応するファイルを開きます(図3A、補足ファイルの付録A)。注: 分析を実行するためにカスタムメイドのプログラムを使用しました。補足ファイルの付録 Aを参照してください。 セルの1st slack後の平均≈60値および平均≈60値(細胞がCa2+ 溶液に浸漬されている場合)これらの2つの値は、それぞれaとbに対応する。 細胞の2番目 のたるみについても同じ分析を繰り返します(細胞がリラックスした溶液に浸漬されている場合)。これらの2つの値は、それぞれcとdに対応する。 a と b の差を計算します (総力、F合計)。 cとdの差を計算します(受動力、Fパッシブ)。 アクティブな力を計算し、Fアクティブ = F合計 – Fパッシブ。 全力値を CSA (上記の式参照) に正規化して、総張力(T合計)、受動的テンション(Tパッシブ)、アクティブテンション(Tアクティブ)を求めます。 2回目 のアクティブ化(pCa=4.5(2))について、ステップ 9.2.1 から 9.2.5 を繰り返します。 これらの値は、分析中の心筋細胞のT総、Tアクティブ およびT受動 を表すものと考えてください。注: pCa4.5(1) を使用したセルの最初のアクティブ化は、通常、セルの寸法の変更に関連付けられます。このため、pCa4.5 による 2 回目のアクティベーションはより正確で、使用する必要があります。 各ファイル/pCa テスト済みソリューション(5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、4.5(3)について、手順9.2.1~9.2.5を繰り返します。 単一の心筋細胞のpCa50およびnHillを計算する。注: この解析では、ファイル 4.5(2)、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、4.5(3) ファイルの非正規化 Fアクティブ 値を使用します。 テストした Ca2+ソリューションごとに、Fの正規化されていない値をすべてスプレッドシート ファイルに配置します (4.5(2)、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、4.5(3))。 補正係数 = Fアクティブ [4.5(2)] – F アクティブ[4.5(3)] / 7 を計算します。 各 Ca2+ソリューション (5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0) の Fアクティブ補正係数を減算して、アクティブなF の補正値を計算します。 各Ca2+解の相対力(F相対)を計算するには、対応する補正値で各Fアクティブ値を正規化します。注: F相対 [4.5(3)] は 1 に等しい必要があります。各実験プロトコルは、Ca2+ 濃度(pCa 4.5(2)および4.5(3))を飽和させると制御活性化で始まり、終了します。これにより、最大Ca2+活性化力(Fmax)の変化の比較を通じて、準備のランダウンの強制正規化と評価が可能になります。実験プロトコルの最後に、心筋細胞が最初の収縮の最大力の少なくとも70%未満を産生する場合、その細胞/測定は分析から除外されるべきである。 F相対値と対応する pCa 値を使用して、次の式 F(Ca) = Ca nHill / (Ca50nHill + CanHill)を持つシグモイド曲線に適合します。 上記の方程式から pCa 値と nHill 値を推定します。 単一の心筋細胞の力再開発率(ktr)を計算します。 1st セルの余裕期間の直後の値に対応するカーブにフィットを実行します。 曲線の傾きを計算すると、この値は力再開発の速度に対応します。 各 Ca2+ ソリューションについて、ステップ 9.4.1 と 9.4.2 を繰り返します。注: 最も低い Ca ソリューション (R 2 乗≤0.90) に対して、カーブフィットが低い値が得られます。