طول الألياف العصبية داخل بنية ثلاثية الأبعاد لمنطقة الدماغ هو معلمة موثوق بها لتحديد سلامة الخلايا العصبية الهيكلية محددة أو انحطاط. هذه المقالة تفاصيل طريقة القياس الكمي ستيريولوجية لقياس طول الألياف الكوليني داخل نواة basalis Meynert في الفئران كمثال.
غالباً ما يرتبط طول المحاور العصبية أو الكولينية الأخرى في مناطق الدماغ المختلفة بالوظيفة المحددة للمنطقة. Stereology هو وسيلة مفيدة لتحديد ملامح الخلايا العصبية من هياكل الدماغ المختلفة. هنا نقدم بروتوكول stereology القائم على البرمجيات لتقدير الطول الإجمالي للألياف الكوليني في نواة basalis من Meynert (NBM) من الدماغ الأمامي القاعدي. تستخدم الطريقة مسبار كرة الفضاء لتقديرات الطول. يتم تصور الألياف الكوليني من قبل أسيتيل ترانسفيز الكولين (ChAT) التلطيخ المناعي مع الفجل بيروكسيديز-ديامينوبنزيدين (HRP-DAB) نظام الكشف. بروتوكول تلطيخ صالح أيضا لتقدير عدد الألياف والخلايا في مختلف مناطق الدماغ باستخدام برنامج stereology. يمكن استخدام بروتوكول الاستريولوجيا لتقدير أي ملامح خطية مثل الألياف الكولينوسيبتيفية ، الألياف الدوبامين / الكاتيوكولامينرجية ، الألياف السيروتونية ، عمليات الخلايا الفلكية ، أو حتى ملامح الأوعية الدموية.
التقديرات الكمية لطول و / أو كثافة الألياف العصبية في الدماغ هي معلمات هامة للدراسات العصبية. غالباً ما يرتبط طول الكوليني, الدوبامين, ومحاور عصبية السيروتونية في مناطق الدماغ المختلفة مع وظائف محددة للمنطقة. لأن توزيع هذه المحاور غير متجانسة عموما، ويستخدم الاستريولوجية القائمة على التصميم لتجنب التحيز أثناء أخذ العينات. وقد تم تصميم مسبار كرة الفضاء من stereology لتوفير تدابير فعالة وموثوق بها من الهياكل مثل خط مثل الألياف العصبية في منطقة ذات أهمية1. يجعل المسبار كرة افتراضية يتم فرضها بشكل منهجي في الأنسجة لقياس تقاطعات الخطوط مع سطح المسبار. لأنه من المستحيل وضع تحقيقات الكرة في الأنسجة للتحليل ، فإن البرنامج المتاح تجاريًا يوفر كرة افتراضية ثلاثية الأبعاد (3D) ، وهي في الأساس سلسلة من الدوائر متحدة المركز ذات الأقطار المختلفة التي تمثل سطح مسبار الكرة.
التنكس العصبي الكوليني الانتقائي هو واحد من السمات الثابتة لمرض الزهايمر (AD)2،3،4. ويعتبر انتقال الكوليني المختل ة عاملا مسببا للتدهور المعرفي في AD. الخلل الكوليني هو واضح أيضا في العديد من الاضطرابات النفسية الأخرى مثل باركنسون, الإدمان, وانفصام الشخصية. تتم دراسة جوانب مختلفة من التنكس العصبي الكوليني في النماذج الحيوانية (على سبيل المثال، الحد من أستيل5، بروتين كات6، التنكس العصبي الألياف الكولينية في محيط لويحات اميلويد6، وانخفاض في الألياف الكولينية والدوالي متشابك7،8). ويعتقد أن انحطاط الألياف يحدث في وقت سابق من فقدان الخلايا العصبية, لأن فقدان الخلايا العصبية الكولينية لا لوحظ دائما في الدراسات. معظم الخلايا العصبية الكولينية في الدماغ القاعدي وجذع الدماغ، ومحاورهم المحورية مشروع إلى مناطق مختلفة في الدماغ مثل القشريات والحصين. يقع NBM في الدماغ الأمامي القاعدي ووجد أنه أحد مناطق الدماغ المصابة بشكل شائع في AD.
ويستند أسلوب كسور من stereology على أخذ العينات العشوائية منهجية من الأنسجة على مستويات متعددة. قسم أخذ العينات الكسر (SSF) هو أخذ العينات المنهجية غير المستندة إلى الكمبيوتر من المقاطع لطريقة كسور من stereology. كسر أخذ عينات المنطقة (ASF) هو كسر منطقة من المنطقة ذات الاهتمام في القسم. سمك كسر أخذ العينات (TSF) هو كسور في سمك مقطع. يسمح لنا مسبار كرة الفضاء بتحديد ملامح الاهتمام في كرة ثلاثية الأبعاد في مواقع مجزأة. هنا نستخدم مسبار كرة الفضاء لتقدير الطول الإجمالي للألياف الكوليني في NBM من دماغ الماوس لتوضيح الإجراءات. يوفر البروتوكول الحالي تفاصيل حول معالجة الأنسجة ، وطرق أخذ العينات لعلم الستريولوجيا ، وتلطيخ الهيستوكيميائية المناعية باستخدام الأجسام المضادة ChAT ، والستيريولوجية غير المتحيزة لتقدير طول الألياف الكولينية وكثافة الألياف في NBM من دماغ الماوس.
هنا نشرح طريقة لتقدير كثافة الألياف الكولينية في NBM باستخدام مسبار كرة الفضاء (الكرة). يقدر هذا المسبار إجمالي طول الألياف في المنطقة ذات الاهتمام. يمكن تقسيم الطول الإجمالي على حجم المنطقة للحصول على كثافة الألياف. ولتقدير حجم المنطقة، استُخدمت طريقة عدد نقاط كافاليري. طريقة عدد نقاط كاف?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال منح إلى W.Z.S. من دائرة البحث والتطوير الطبي، وإدارة شؤون المحاربين القدامى (مراجعة الجدارة 1I01 BX001067-01A2)، وجمعية الزهايمر (NPSPAD-11-202149)، وموارد من الغرب الأوسط الطبية الحيوية مؤسسة البحوث.
ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |