تقدير الألياف الكولينية في النواة باساريس من Meynert من دماغ الفأر
Summary
طول الألياف العصبية داخل بنية ثلاثية الأبعاد لمنطقة الدماغ هو معلمة موثوق بها لتحديد سلامة الخلايا العصبية الهيكلية محددة أو انحطاط. هذه المقالة تفاصيل طريقة القياس الكمي ستيريولوجية لقياس طول الألياف الكوليني داخل نواة basalis Meynert في الفئران كمثال.
Abstract
غالباً ما يرتبط طول المحاور العصبية أو الكولينية الأخرى في مناطق الدماغ المختلفة بالوظيفة المحددة للمنطقة. Stereology هو وسيلة مفيدة لتحديد ملامح الخلايا العصبية من هياكل الدماغ المختلفة. هنا نقدم بروتوكول stereology القائم على البرمجيات لتقدير الطول الإجمالي للألياف الكوليني في نواة basalis من Meynert (NBM) من الدماغ الأمامي القاعدي. تستخدم الطريقة مسبار كرة الفضاء لتقديرات الطول. يتم تصور الألياف الكوليني من قبل أسيتيل ترانسفيز الكولين (ChAT) التلطيخ المناعي مع الفجل بيروكسيديز-ديامينوبنزيدين (HRP-DAB) نظام الكشف. بروتوكول تلطيخ صالح أيضا لتقدير عدد الألياف والخلايا في مختلف مناطق الدماغ باستخدام برنامج stereology. يمكن استخدام بروتوكول الاستريولوجيا لتقدير أي ملامح خطية مثل الألياف الكولينوسيبتيفية ، الألياف الدوبامين / الكاتيوكولامينرجية ، الألياف السيروتونية ، عمليات الخلايا الفلكية ، أو حتى ملامح الأوعية الدموية.
Introduction
التقديرات الكمية لطول و / أو كثافة الألياف العصبية في الدماغ هي معلمات هامة للدراسات العصبية. غالباً ما يرتبط طول الكوليني, الدوبامين, ومحاور عصبية السيروتونية في مناطق الدماغ المختلفة مع وظائف محددة للمنطقة. لأن توزيع هذه المحاور غير متجانسة عموما، ويستخدم الاستريولوجية القائمة على التصميم لتجنب التحيز أثناء أخذ العينات. وقد تم تصميم مسبار كرة الفضاء من stereology لتوفير تدابير فعالة وموثوق بها من الهياكل مثل خط مثل الألياف العصبية في منطقة ذات أهمية1. يجعل المسبار كرة افتراضية يتم فرضها بشكل منهجي في الأنسجة لقياس تقاطعات الخطوط مع سطح المسبار. لأنه من المستحيل وضع تحقيقات الكرة في الأنسجة للتحليل ، فإن البرنامج المتاح تجاريًا يوفر كرة افتراضية ثلاثية الأبعاد (3D) ، وهي في الأساس سلسلة من الدوائر متحدة المركز ذات الأقطار المختلفة التي تمثل سطح مسبار الكرة.
التنكس العصبي الكوليني الانتقائي هو واحد من السمات الثابتة لمرض الزهايمر (AD)2،3،4. ويعتبر انتقال الكوليني المختل ة عاملا مسببا للتدهور المعرفي في AD. الخلل الكوليني هو واضح أيضا في العديد من الاضطرابات النفسية الأخرى مثل باركنسون, الإدمان, وانفصام الشخصية. تتم دراسة جوانب مختلفة من التنكس العصبي الكوليني في النماذج الحيوانية (على سبيل المثال، الحد من أستيل5، بروتين كات6، التنكس العصبي الألياف الكولينية في محيط لويحات اميلويد6، وانخفاض في الألياف الكولينية والدوالي متشابك7،8). ويعتقد أن انحطاط الألياف يحدث في وقت سابق من فقدان الخلايا العصبية, لأن فقدان الخلايا العصبية الكولينية لا لوحظ دائما في الدراسات. معظم الخلايا العصبية الكولينية في الدماغ القاعدي وجذع الدماغ، ومحاورهم المحورية مشروع إلى مناطق مختلفة في الدماغ مثل القشريات والحصين. يقع NBM في الدماغ الأمامي القاعدي ووجد أنه أحد مناطق الدماغ المصابة بشكل شائع في AD.
ويستند أسلوب كسور من stereology على أخذ العينات العشوائية منهجية من الأنسجة على مستويات متعددة. قسم أخذ العينات الكسر (SSF) هو أخذ العينات المنهجية غير المستندة إلى الكمبيوتر من المقاطع لطريقة كسور من stereology. كسر أخذ عينات المنطقة (ASF) هو كسر منطقة من المنطقة ذات الاهتمام في القسم. سمك كسر أخذ العينات (TSF) هو كسور في سمك مقطع. يسمح لنا مسبار كرة الفضاء بتحديد ملامح الاهتمام في كرة ثلاثية الأبعاد في مواقع مجزأة. هنا نستخدم مسبار كرة الفضاء لتقدير الطول الإجمالي للألياف الكوليني في NBM من دماغ الماوس لتوضيح الإجراءات. يوفر البروتوكول الحالي تفاصيل حول معالجة الأنسجة ، وطرق أخذ العينات لعلم الستريولوجيا ، وتلطيخ الهيستوكيميائية المناعية باستخدام الأجسام المضادة ChAT ، والستيريولوجية غير المتحيزة لتقدير طول الألياف الكولينية وكثافة الألياف في NBM من دماغ الماوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نشرح طريقة لتقدير كثافة الألياف الكولينية في NBM باستخدام مسبار كرة الفضاء (الكرة). يقدر هذا المسبار إجمالي طول الألياف في المنطقة ذات الاهتمام. يمكن تقسيم الطول الإجمالي على حجم المنطقة للحصول على كثافة الألياف. ولتقدير حجم المنطقة، استُخدمت طريقة عدد نقاط كافاليري. طريقة عدد نقاط كاف?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح إلى W.Z.S. من دائرة البحث والتطوير الطبي، وإدارة شؤون المحاربين القدامى (مراجعة الجدارة 1I01 BX001067-01A2)، وجمعية الزهايمر (NPSPAD-11-202149)، وموارد من الغرب الأوسط الطبية الحيوية مؤسسة البحوث.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
Referencias
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology–reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
