عاليه الانتاجيه الكلي الداخلية انعكاس الفلورية والتوجيه العشوائي البصرية أعاده البناء المجهري باستخدام رقاقه فوتوسونيك
Summary
المجهر البصري فائقه الدقة المستندة إلى الرقاقة هو نهج جديد للمجهر الفلوري ويقدم مزايا في فعاليه التكلفة والانتاجيه. هنا ، يتم عرض بروتوكولات لاعداد رقاقه والتصوير لمجهر TIRF والتعريب المستندة إلى المجهر فائقه الدقة.
Abstract
ويشيع استخدام إجمالي الانعكاس الداخلي (TIRF) في التعريب جزيء واحد علي أساس المجهر فائقه الدقة كما انه يعطي التباين المعزز بسبب التحليل البصري. النهج التقليدي هو استخدام المجهر الرقمي عاليه الفتحة الأهداف TIRF لكل من الاثاره وجمع ، والحد بشده مجال الرؤية والانتاجيه. نقدم نهجا جديدا لتوليد الاثاره TIRF للتصوير مع الموجات الموجية البصرية ، ودعا التنظير القائم علي رقاقه. الهدف من هذا البروتوكول هو توضيح كيفيه تنفيذ التصوير المستند إلى الرقاقة في اعداد تم بناؤه بالفعل. الميزة الرئيسية من التنظير القائم علي رقاقه هو ان يتم فصل مسارات الاثاره وجمع. ويمكن بعد ذلك ان يتم التصوير مع عدسه التكبير منخفضه ، مما ادي إلى مجال كبير من الصور TIRF الرؤية ، بسعر انخفاض طفيف في القرار. خلايا الكبد الغشائية الحلقية (LSECs) كانت باستخدام المجهر البصري العشوائي المباشر لأعاده البناء (العاصفةd) ، والتي تظهر قرارا مشابها لمجاهر الدقة الفائقة التقليدية. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نظهر قدرات عاليه الانتاجيه عن طريق التصوير 500 μm x 500 μm المنطقة مع عدسه التكبير منخفضه ، وتوفير قرار من 76 نانومتر. من خلال شخصيتها المدمجة ، يمكن تحديث التصوير القائم علي الرقاقات في المجاهر الأكثر شيوعا ويمكن دمجها مع التقنيات البصرية الأخرى علي الرقاقة ، مثل الاستشعار علي الرقاقة ، والطيف الطيفي ، والملائمة البصرية ، الخ. التالي فان هذه التقنية مناسبه بشكل مثالي للتصوير فائق الدقة ثنائي الابعاد ، ولكنها توفر أيضا فرصا كبيره للتحليل متعدد الوسائط.
Introduction
منذ المظاهرة الاولي من جزيء واحد المجهر التعريب ، وقد وضعت العديد من الاختلافات لحل التحديات المختلفة1،2،3. واحد التحديات التي ظلت ، ومع ذلك ، هو مجال كبير من وجهه نظر dSTORM التصوير. العديد من الاجهزه dالعاصفة استخدام نفس العدسة الهدف لكلا تثير العينة والصورة عليه. من أجل زيادة مجال الرؤية ، هناك حاجه إلى عدسه التكبير منخفضه. العدسات الموضوعية منخفضه التكبير ومنخفضه الفتحة العددية (NA) عاده ما يكون لها عمق كبير في الحقل ، مما يؤدي إلى زيادة الاشاره خارج الطائرة التي ستقلل من دقه التعريب. ويشيع استخدام أهداف TIRF لزيادة التباين في الصورة عن طريق الحد من الفلورية خارج الطائرة. من خلال [تيرف], حددت الاثاره إلى سماكه بصريه من تقريبا 150 [نم] من السطح بواسطة [افيسسنت] مجال4. العدسات الموضوعية TIRF تتطلب NA كبيره مما ادي إلى مجال صغير من الرؤية (فوف) (علي سبيل المثال ، 50 x 50 μm2) ، مما يحد من الانتاجيه بشكل ملحوظ. ومع ذلك ، هناك طرق بديله لتوليد حقل التخدير.
دليل الموجي البصري هو الهيكل الذي سيتم حصر وتوجيه الضوء إذا كان يقترن في الهيكل. الأكثر شيوعا ، وتستخدم الموجات الموجية في الاتصالات القائمة علي ألياف. وقد بذلت جهود كبيره من أجل تطوير الموجات الموجية المتكاملة ثنائيه الابعاد كمكون رئيسي للدوائر المتكاملة الضوئية. وقد تقدمت التكنولوجيا إلى نقطه حيث افتعال المنخفضة الخسارة نانو منظم الموجات البصرية يمكن ان يتم بشكل روتيني5. اليوم ، يمكن استخدام العديد من المصهر في جميع انحاء العالم لتطوير الدوائر المتكاملة ضوئيه. دليل الموجات الموجية الضوء من خلال الانعكاس الداخلي الكلي أيضا إظهار حقل التخدير علي السطح. من خلال تصميم دقيق للهيكل الموجه الموجي ، يمكن تحقيق كثافة عاليه في حقل التخدير. التالي يمكن أيضا ان تكون العينة الموضوعة مباشره فوق سطح الموجه الموجي مضيئه بواسطة الحقل الذي لا يمكن التخدير منه لتطبيقات التصوير. سيتم إنشاء حقل التخدير علي طول طول وعرض الموجه الموجي ، التالي فانه يمكن جعلها كبيره بشكل تعسفي6.
نقدم نهجا جديدا ل TIRF dالعاصفة التي توفر مجالا واسعا بشكل اعتباطي للراي. بدلا من استخدام عدسه TIRF لكل من الاثاره وجمع ، ونحن تثير استخدام حقل evتخدير من الموجات الموجية البصرية. هذا يفصل الاثاره وجمع مسار الضوء ، مما يسمح للحرية الكاملة علي طول مسار الضوء جمع دون المساومة البصرية التماس لطول موجي معين المقدمة من قبل الاضاءه رقاقه الموجه الموجي. التالي يمكن استخدام عدسات التكبير منخفضه لصوره مناطق كبيره جدا في وضع TIRF ، علي الرغم من ان NA أصغر سيقلل من القرار الجانبي. وعلاوة علي ذلك ، يتم أيضا تبسيط التصوير متعدد ألوان بشكل كبير باستخدام الموجات الموجية7، حيث يمكن توجيه العديد من الأطوال الموجية والكشف عنها دون تعديل النظام. هذا هو المفيد ل dالعاصفة ، كما يمكن استخدام أطوال موجية منخفضه لتعزيز الوميض فلوكوفيري والتصوير متعدد ألوان. ومن الجدير بالذكر ان عمق تغلغل حقل التخدير سيتغير كداله طول الموجه ، علي الرغم من انه لا يؤثر علي كيفيه تنفيذ اجراء التصوير. رقاقه متوافق مع التصوير الخلية الحية8 ومثاليه للتطبيقات مثل دمج ميكروفلويديكس. كل رقاقه يمكن ان تحتوي علي عشرات من الموجات الموجية ، والتي يمكن ان تسمح للمستخدم للصورة تحت ظروف مختلفه أو تطبيق تراكب البصرية9 ورامان الطيفي10.
يعمل النظام القائم علي الرقاقات بشكل جيد علي حد سواء للتصوير المحدود والفائق الدقة. وادخل نهج مماثل في 2005 باستخدام المنشور لتوليد الاثاره الميدانية evتخدير4. الرقاقة الضوئية يثير أيضا من خلال حقل evتخدير ، ولكن مع تقنيات التوجيه الموجي الحديثة ، يمكن للمرء ان يولد أنماط الضوء الغريبة مع الموجات الموجية. يقتصر التطبيق الحالي لتنظير النانو القائم علي الرقاقة علي التصوير ثنائي الابعاد فقط ، حيث يتم تامين حقل الاثاره داخل سطح الموجه الموجية. وسوف تهدف التنمية في المستقبل للتطبيقات 3D. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تطوير تقنيات الدقة الفائقة الأخرى مثل المجهر الضوئي المنظم باستخدام نفس المنظار القائم علي الرقاقة11.
Protocol
Representative Results
Discussion
يشبه التصوير القائم علي الرقاقة التصوير التقليدي لعاصفه d. التالي يمكن قياس جوده الصورة باستخدام نفس النهج المتبعة في التصوير التقليدي لعاصفه d. الفرق الرئيسي للمستخدم هو ان يتم تبادل الشريحة الزجاجية الشفافة مع Si-رقاقه مبهمه. علي الرغم من انها تظهر مختلفه جدا ، معالجه العينة مشابه عمليا إلى شريحة زجاجيه. رقائق قويه جدا ويمكن بسهوله التعامل معها باستخدام ملاقط رقاقه. اجراء التصوير وأعاده بناء الصورة هو نفسه كما هو الحال في تجربه العاصفة dالعادية. اعداد المجهر القائم علي رقاقه وظيفية لا يتطلب مكونات خاصه ، باستثناء رقائق الضوئية. ويمكن الاطلاع علي مزيد من التفاصيل عن الاعداد في العمل السابق6و7. وقد تم ملفقه رقائق المستخدمة في هذا العمل باستخدام التصوير الضوئي القياسية8.
اعداد العينة يشمل اعداد غرفه العينة. عند إرفاق الإطار PDMS إلى رقاقه ، فمن المهم لتجنب اي طيات صغيره أو تمزقات حيث قد يدخل الهواء. إذا طيات PDMS عند إرفاقه ، ببساطه ازالته بعناية مع ملقط وأعاده توصيله. عندما تكون العينة جاهزه داخل غرفه PDMS ، يجب الضغط علي زجاج الغلاف ضدها ، وختم المنطقة. من المهم لتجنب اي فقاعات الهواء التي قد تشكل عند إرفاق غطاء زجاجي. إذا تم تشكيل فقاعه الهواء ، وأزاله برفق زجاج الغطاء وأضافه تلفزيوني إلى غرفه عينه للتاكد من ان يتم تغطيه العينة. ويمكن بعد ذلك ببساطه أعاده اعداد وإرفاق زلة الغطاء.
يتم تبسيط اقتران الضوء في دليل الموجي باستخدام البروتوكول المقترح في هذه الورقة. ومع ذلك ، هناك بعض التحديات المشتركة التي يمكن ان تحد من الاقتران. أولا ، إذا لم يتم تنظيف رقاقه بشكل صحيح وأي بقايا تلفزيوني ازالتها تماما ، قد يكون هناك الأوساخ أو تبلور تلفزيوني علي الدليل الموجي. وهذا يمكن ان يدخل خسائر كبيره ، مما ادي إلى القليل جدا من السلطة في منطقه التصوير. يمكن استخدام مسحه رطبه لتنظيف المنطقة خارج الغطاء الزجاجي تحسين الطاقة بشكل كبير. ثانيا ، إذا كان الجانب اقتران من الدليل الموجي معطوب (علي سبيل المثال ، عن طريق المناولة غير السليمة) ، فان فقدان اقتران يمكن ان تزيد بشكل كبير. التفتيش البصري للحافه وعاده ما تكشف عن اي اضرار بسهوله. ويمكن مصقول وجه اقتران كامل من رقاقه بعناية ، مثل الكثير من ألياف البصرية ، وسوف تعطي وجها السلس اقتران ، والتي ثم يزيد من السلطة إلى جانب.
بعد ان يقترن الضوء ، واجراء التصوير هو نفسه كما هو الحال في اي الاعداد العاصفة dالتقليدية. إذا كانت الصورة غير متجانسة الاثاره ، كما هو موضح في الشكل 2ا، ثم علي الأرجح وضع المتوسط لا يعمل بشكل جيد. والسببان الأكثر شيوعا لذلك هما: 1) عدد قليل جدا من الصور الملتقطة من أجل إنشاء مكدس متوسط و 2) قصيرة جدا من مسافة التذبذب/كبيره جدا من حجم الخطوة. جمع عدد قليل جدا من الصور يمكن ان تترك بعض أنماط الاثاره التالي فان المتوسط يكون غير متجانس. يمكن حل هذا بسهوله عن طريق زيادة عدد الصور في متوسط المكدس. قصيرة جدا من مسافة التذبذب يمكن ان يؤدي أيضا إلى صوره غير متجانسة ، كما لا توجد أنماط وضع كافيه متحمس. ويمكن أيضا حل هذه المشكلة بسهوله عن طريق زيادة مسافة التذبذب و/أو تقليل حجم الخطوة. في هذا العمل استخدمنا مرحله بيزو لمسح شعاع الليزر الإدخال أكثر من 20 μm والحصول علي ما لا يقل عن 300 الصور. يمكن ان يكون نهج آخر لاستخدام عاليه السرعة galvo-المرايا لمسح الضوء عبر الوجه الموجي دليل المدخلات في وقت واحد اكتساب ، مثل 10-30 ms. هذا الخيار هو مناسبه للتصوير TIRF الخلية الحية ، حيث العضوية الفرعية الخلوية في الحركة المستمرة.
رقاقه القائم dالعاصفة يقدم منطقه كبيره غير مسبوقة tirf الاثاره ، مما يجعلها مناسبه بشكل مثالي للتصوير عاليه الانتاجيه. يسمح الحرف المدمج بالتعديل التحديثي للانظمه التجارية ، حيث يمكن وضع الرقاقة راسا علي عقب للاجهزه المقلوبة أو يمكن تطوير ركائز شفافة. رقائق هي كتله ملفقه ويمكن تعديلها لتناسب العديد من الاحتياجات. حاليا ، القيد الرئيسي هو انه يقتصر علي 2D. لا يتوفر حقل التخدير الا تقريبا 200 نانومتر بعيدا عن سطح الموجه الموجي ، التالي فان الفلوروبيورس فقط داخل هذه المنطقة سيكون متحمسا. الإجمال ، فان مجال البصريات المتكاملة يوفر العديد من الفرص للحصول علي المجهر القائم علي الرقاقات في المستقبل القريب ، من خلال معالجه اسئله التصوير الجديدة ، فضلا عن توفير إمكانيات جديده لتلك الموجودة.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بالمجلس الأوروبي للبحوث (المنحة رقم 336716 إلى B.S.A.). ويود أصحاب البلاغ أيضا ان يشكروا ايراتي لاغفرااغوا علي مساعدتها القيمة في تسجيل الفيديو وتحريره.
Materials
| 1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
| 2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
| 3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
| BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
| CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
| Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
| Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
| Filter Holder | Homemade | ||
| Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
| KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
| Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
| Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
| Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
| Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
| Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |
Referencias
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
- Jalali, B., Fathpour, S. Silicon photonics. Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).
- Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).
- Diekmann, R., et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy. Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).
- Tinguely, J. C., Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).
- Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).
- Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).
- Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV Available from: https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019)
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
- Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).
