Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures
Summary
Les cultures de tranches organotypiques sont un outil puissant pour étudier les processus neurodéveloppementaux ou dégénératifs/régénérateurs. Ici, nous décrivons un protocole qui modélise la mort neurodéveloppementale des cellules de Purkinje dans les cultures de tranche de cévedrillon de souris. Cette méthode peut bénéficier à la recherche dans la découverte de médicaments neuroprotecteurs.
Abstract
La culture de tranches organotypiques est un modèle in vitro puissant qui mimicks in vivo conditions plus étroitement que les cultures cellulaires primaires dissociées. Au début du développement postnatal, les cellules cérévelaires de Purkinje sont connues pour passer par une période vulnérable, au cours de laquelle elles subissent la mort cellulaire programmée. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer la culture de tranche de cervelateur organotypic de souris pendant ce temps critique. Les tranches sont également étiquetées pour évaluer la survie des cellules de Purkinje et l’efficacité des traitements neuroprotecteurs. Cette méthode peut être extrêmement utile pour dépister de nouvelles molécules neuroactives.
Introduction
La modélisation in vitro est un outil essentiel de la recherche biomédicale. Il permet aux chercheurs d’étudier et de contrôler étroitement des mécanismes spécifiques dans les types de cellules restreintes, ou dans des systèmes/organes isolés. La culture de tranches organotypiques est une technique in vitro largement utilisée, en particulier dans le domaine des neurosciences1. La méthode a d’abord été mise en place par le président Dehwiler, qui a cultivé des tranches de cerveau en utilisant la technique du tube à rouleaux2, puis modifiée par Yamamoto et coll., qui ont introduit l’utilisation d’une membrane microporeuse pour effectuer des cultures de tranches corticales3. Comparéaux aux cultures cellulaires primaires, les cultures de tranches organotypiques présentent l’avantage de préserver la cytoarchitecture du tissu, ainsi que les connexions cellulaires-cellules indigènes dans le plan de la section tissulaire.
Les tranches organotypiques ont été cultivées à partir de nombreuses parties du système nerveux central, comme l’hippocampe4, cortex5, striatum6, cervelet4,7, et la moelle épinière8,9, entre autres. Ils se sont avérés être un outil puissant dans les études de découverte de médicaments10. Les effets des molécules neuroactives peuvent être évalués de plusieurs façons : survie et neurodégénérescence à l’aide d’analyses d’immunostaining et de biochimie, formation de circuits neuronaux ou perturbation à l’aide de l’électrophysiologie et de l’imagerie vivante.
Le but de ce travail est de décrire une méthode simple pour effectuer la culture de tranche de cervelateur organotypic, qui est connu pour être un modèle pertinent pour imiter le développement cérécolal in vitro. En particulier, nous nous sommes concentrés sur l’étude de la mort développementale de cellules de Purkinje. In vivo, les cellules de Purkinje subissent l’apoptose au cours de la première semaine postnatale, avec un pic au jour postnatal 3 (P3)11. Le même modèle est observé dans la culture de tranche de céveineux, avec des neurones purkinje mourir par apoptose quand les cerveleux sont pris des animaux entre P1 et P8, avec un pic à P34,12. L’utilisation des cultures de tranches de cervelage organotypiques a permis d’identifier plusieurs molécules neuroprotectrices7,13, ainsi que de comprendre une partie des mécanismes impliqués dans cette mort cellulaire programmée14,15,16. Ici, nous décrivons un protocole basé sur l’étude de Stoppini et autres17 dans l’hippocampe, et adapté au cervelet par Dusart et autres4 Il inclut la dissection rapide et le hachage du cerebella postnatal ; trancher la culture sur un insert de culture cellulaire contenant une membrane microporeuse, avec ou sans traitement neuroprotecteur; et la coloration d’immunofluorescence pour évaluer la survie neuronale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La culture de tranches de céveltove est un outil puissant pour étudier la mort cellulaire programmée de Purkinje pendant le développement postnatal. Cette technique peut être utilisée pour dépister rapidement les molécules candidates pour leur potentiel neuroprotecteur. Le principal avantage est que la configuration est simple et très rentable, et ne nécessite qu’un investissement modeste dans l’équipement (un vibratome peut coûter jusqu’à 3 fois plus cher qu’un hélico de tissu). En outre, 10 à 15 tranches…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux d’imagerie ont été réalisés au Northwestern University Center for Advanced Microscopy généreusement soutenu par NCI CCSG P30 CA060553 décerné au Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Nous remercions Sean McDermott pour son assistance technique et son soutien, et Maya Epstein pour les illustrations dessinées à la main présentées à la figure 1.
Materials
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
Referencias
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