正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

1. サンプル調製 細胞質蛍光タンパク質6を発現するように設計するか、膜色素5を用いて、イメージング用に大腸菌蛍光を作る。他の細菌種は、大腸菌の代わりに使用することができます。 細胞質mCherry蛍光タンパク質をコードするプラスミドを用いてエレクトロポレーションを介して細胞を形質転換する。注:の他の色の異なる蛍光タンパク質を使用することができる。 37°Cで適切な抗生物質でLBプレート上の形質転換体を成長させます。単一のコロニーを取得し、顕微鏡検査によって陽性クローンを同定する。顕微鏡の下に赤く見える抗生物質耐性コロニーには、mCherryを運ぶプラスミドが含まれている。 LB液体媒体中の一晩培養物の2mLを、振とうインキュベーターで37°Cの適切な抗生物質で成長させる。プレートのコロニーまたは少量の冷凍庫ストックを接種品として使用します。注:実験に選択した細菌細胞に必要な媒体を使用します。 一晩培養1:1,000を新鮮なLB媒体の5mLにサブカルチャーし、3-4時間の振とうインキュベーターで細胞を37°Cで指数位相まで成長させ、細胞のOD600を測定して指数位相に入っていることを確認する(すなわち.、OD600 = 0.2−0.4)。注:イメージングは、行われている実験に応じて任意の成長段階で行うことができる。 2. スライドの準備 注:自己蛍光の少ないメディアを使用することが重要です。自己蛍光が低い任意の媒体を使用することができます。この実験では、1%アガロースM63最小限のメディアパッドとVaLaP19によるシールが3Dで細胞を画像化するために必要とされる。 最小限のメディアの20 mLでアガロースの1%溶液を準備します。 アガロースが完全に溶解し、溶液が明確に表示されるまで溶液をマイクロ波。 溶液は、使用する準備ができるまで60°水浴に保管してください。注:この溶液は、必要に応じて固化して溶融することも、必要に応じて溶融する少量に引用することもできる。複数の使用後、メディアが変色し、交換する必要があります。 80-100°Cのホットプレート上の溶融VaLaPシーラント。注:VaLaPを調製し、シーラントとして使用し、80−100°Cのホットプレート上のビーカーにそれぞれ50gの石油ゼリー、ラノリン、パラフィンを一緒に溶かすことによって使用する。この大量のVaLaPは室温で無期限に保存することができ、>500スライドで十分です。>100 °Cで加熱すると劣化し、色が暗くなります。 スライドの反対側の端に、20 mm x 20 mm のカバースリップを 3 つずつ 2 つ積み重ねます(合計 6 枚のカバースリップ)。 アガロースパッド溶液のピペット200μLをスライドに。注:工学的蛍光染色を使用しない場合は、この工程の前に膜色素をアガロースパッド溶液に添加してもよい。水に染料を再スペンドし、アガロースパッド溶液の1 mLに染料を5μg/mLの最終濃度に加えます。 すぐにしっかりとカバースリップのスタックの上に2番目のスライドを置いて寒天を平らにし、室温で1分間固まらせます。 上部スライドから慎重にスライドします。 200°Lピペット先端の大きな端を使用して、スライド上のゲル(直径約5mm)から個々のパッドを切り取り、不正なゲルまたは不要なゲルを廃棄します。注:複数の株または条件をイメージングする場合は、それぞれに個別のパッドが必要になります。1 つのひずみをイメージする場合は、カバースリップをサポートするために 3-4 パッドを作成します。 ピペット細胞は、細胞の塊を破壊し、培養がよく混合されていることを確認するために、複数回上下に細胞。ピペット1μLのステップ1.3からパッド上へ。注:細胞形状の再構成には、他の細胞に触れていない個々の細胞が必要です。定常相または高細胞密度培養物を使用する場合は、パッド上に配置する前にサンプルを1:10に希釈する必要がある場合があります。 サンプル空気を5~10分間乾燥させてください。液体が残っている場合、細胞は液体内を移動し、画像化することはできません。 パッドの上部にカバースリップを置きます。 綿棒でカバースリップの縁を軽くブラッシングして、溶かしたVaLaPでカバースリップを密封します。目的が触れるカバースリップの上部から離してください。VaLaPは数秒で硬化し、サンプルを密封します。 すぐにサンプルをイメージします。注:サンプルは、スライドの準備が完了したらすぐに画像化する必要があります。細胞はパッド上で成長することができ、それらが再構成を分割する場合、より困難になります。 3. イメージング要件 z または顕微鏡の集束軸が 50 nm 未満の正確な動きを行うことができることを確認します。一般的な電動フォーカスデバイスではこの精度を提供できないため、研究グレードの顕微鏡で入手可能なz piezoステージ(材料表を参照)を使用してください。注:ナイキスト・シャノンのサンプリング基準20を仮定すると、1つは、最小の目的のステップサイズ、または2倍の目的の空間周波数を0.5倍に移動する能力を持っている必要があります。このプロトコルで必要な 100 nm ステップでは、精度が 50 nm 以下のステージが必要です。 顕微鏡に1.45の最小開口(NA)の100倍の目標が含まれていることを確認します。 200 ~ 400 の異なるセルの Z スタックを収集して、下流アプリケーションに十分なセルが得られるようにします。注:必要なセルの数は、対象のサンプルの基になる変動性によって異なります。この時点で収集された細胞の中には、再構成手順を通じてそれを作らないものがあります。 二次蛍光チャネル(タンパク質、代謝標識など)を測定する場合は、Zスタックが形状チャネルに使用される設定と一致していることを確認します。 4. イメージング 密閉されたスライドを顕微鏡に挿入し、顕微鏡室がサンプル調製室とは異なる温度にある可能性があるため、周囲と温度を平衡化するために5分間座るようにします。 試料の蛍光Zスタックを取る。注: Z スタックは、被写界深度よりも短い Z 間隔でサンプルを完全にカバーする必要があります。1.45 NA 100xの目的および約1μmの厚い大腸菌細胞の場合、ステップあたり100 nmで40ステップがうまく機能します。表面に完全に平らに置かっていない大きな細胞や細胞の場合は、50以上のステップが必要な場合があります。十分な手順を含め、サンプルが上下に完全にぼやけているようにします。 顕微鏡に関連付けられたソフトウェア(「材料表」を参照)を使用して、顕微鏡を制御します。 顕微鏡の焦点の車輪を使用して細胞の中央に焦点を当てる。[ND取得]で[Z] ボックスをオンにして Z スタックを取得します。[ホーム]ボタンをクリックして、セルの中央を開始点として設定します。ステップサイズを0.1μmに設定し、[範囲]を4μmに設定します。 ラムダウィンドウの下の蛍光チャンネルを、画像化する蛍光分子の設定に設定します。この実験ではGFPおよびmCherryを用いた。注:追加の蛍光チャネルの 3D 分布が必要な場合は、2 番目のカラー チャネルで同じステップ サイズと範囲を持つ追加の Z スタックを使用します。この実験では、細胞質mCherryを用いて細胞形状を決定し、MreB-GFPを第2のカラーチャネル21として用いた。 切り替える前に、各カラー チャンネルで完全な Z スタックを使用できるように、実験の順序がラムダ (z シリーズ) に設定されていることを確認します。 [今すぐ実行]をクリックしてイメージの取得を開始し、一方または両方の z スタックが完了したファイルを保存します。 パッド上の新しい領域に移動し、手順 4.2.2 から 4.2.5 を繰り返します。 5. 細胞再建 個々のセルをトリミングし、ファイルごとに 1 つのセルしか存在するように、イメージを積み重ねられた tiff ファイルとして保存します。このセルが他のセルから十分に分離されていることを確認します (つまり、ぼかし関数の全角半最大値の約 5 倍を xy 単位で指定します)。注:これは、自由に利用できる画像解析ソフトウェアを使用して行うことができます(材料表を参照)。 個々のセルの周囲にボックスを描画し、そのセル 2x をチャネルごとに 1 回複製します。[ハイパースタックの重複] ボックスがオンになっていることを確認し、チャネルを 1 または 2 に変更して、スライスに z スタック全体が含まれていることを確認します。注:細胞の形状のみを画像化し、追加の蛍光タンパク質をイメージングしない場合は、1つのチャネルのみが存在します。 両方のスタックが使用可能になったら、イメージ |スタック |ツール |画像を最初にタンパク質チャネルと組み合わせ、形状チャネルを第2に連結する。 新しいイメージを tiff ファイルとして保存します。 サブ回折限定蛍光ビーズ22を用いて顕微鏡のぼかし機能を測定する。これは、顕微鏡および顕微鏡の目的ごとに行う必要がありますが、目的のサンプルをイメージングする前または後に行うことができます。 利用可能なソフトウェアを使用して手動介入を行う複数の独立したビーズを平均化します(材料表を参照)。注:最終製品は、目的のサンプルと同じ xyz 間隔を持つぼかし関数の 3D イメージである必要があります。 使用可能なソフトウェアを使用して、前方畳み込みセル形状再構成スクリプトを実行します。これらのスクリプトの最新バージョンは、https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-publicから自由にダウンロードできます。 トリミングされたイメージとshae-cellshape-public/exampleData_tri からセルシェイプ_settings_tri.txtファイルを含むフォルダをデスクトップ上のフォルダに作成します。 セル図形を編集して、目的の実験に適した設定を行います。この実験では、設定ファイルに次の行が含まれています。nm_per_pixel 70Zスケール 0.65スタック_zサイズ 41スタック t サイズ 1Fstack_z_size 41Fstack_t_size 1スタック-セペレーション_nm 100Fstack_seperation_nm 100psfScript -999 osuPSF20180726グラデーション 1注:このテキスト ファイルはセクションに編成され、各セクションは独自の変数に解析されます。設定の多くは実験から実験に変更する必要はありませんが、Z スタックのサイズ (形状の場合はstack_z_size、対象のタンパク質の場合は Fstack_z_size)、zスタックの間隔(stack_seperation_ ) を確認する必要があります。nm, Fstack_seperation_nm), 顕微鏡の相対的な焦点シフト (Z_scale)23, xy (nm_per_pixel) のピクセルサイズと、顕微鏡のぼかし関数をロードするスクリプトの名前 (psfScript)は実験と一致します。図形チャネルが細胞化的に塗りつぶされている場合はグラデーションフィールドを 1 に設定し、膜染色されたオブジェクトの場合は 0 に設定する必要があります。 文字列をフォルダの場所に続けて開始するセルの数と実行するセルの数を指定して、セルシェイプ_detector3dConvTriFolder関数 (shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/) を実行します。注:入力の例は次のようになります: Cell_shape_detector3dConvTriFolder (「トリミングされた画像を含むフォルダーへのパス」、フォルダー内のインデックスの開始、セルの数)。一般的なセルは、再構築が収束して終了するまでに 5 ~ 20 分かかる場合があります。 統計的分析にセルを使用する前に、セルの再構成をスクリーニングして正しいことを確認します。 ScreenFits (shae-cellshape-public/shae-fitViewerGui/) を実行して、個々のセルの再構成を視覚的にスクリーニングします。 グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) が開いたら [フォルダーの選択] ボタンをクリックし、手順 5.3 で作成した再構築データ ファイル (TRI.mat) を含むフォルダーを選択します。 セルの再構築の横にあるボックスを選択します (図 3)。これは、穴のあるセル、平らな側面、または分岐が出てくるように見えます。これにより、ファイル名に ‘FLAG’ が追加され、ダウンストリーム分析から除外できます。注:再構築されたセルは、元の画像と比較できます。これは、細胞がさまざまな異種の図形の集団から来る場合に特に重要です。 エンリッチメントSmoothingSpline(shae-cellshape-public/)を実行して、表面のガウス曲率の関数として目的のタンパク質の相対濃度の濃縮プロファイルを作成します。 手順 5.3.3 で作成した TRI.mat ファイルを含む各フォルダを選択します。 新しく作成した (5.5.1) curve.mat ファイルを選択します。注:5.5.1 で選択したフォルダごとに curve.mat ファイルが作成されます。すべてのエンリッチメントプロファイルが1つのグラフに表示されます。フォルダごとに 5.5 を実行するよりも個々のグラフが必要な場合。注:蛍光タンパク質の正確な幾何学的局在化に加えて、オブジェクト4の数、サイズ、および向きをカウントするなど、二次チャネルからのデータを分析する他の多くの方法があります。