정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징
Summary
이 프로토콜은 살아있는 3차원 이미징을 위해 세균 샘플을 준비하고 장착하는 방법과 이러한 이미지에서 대장균의 3차원 모양을 재구성하는 방법을 설명합니다.
Abstract
박테리아의 모양은 생리학에 중요합니다. 세포 운동성, 세포 및 생물막 생산과 같은 세포 생리학의 많은 양상은 세포 모양에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 세균성 세포는 거의 같이 취급되지 않더라도, 3차원 (3D) 객체입니다. 대부분의 현미경 기술은 단백질의 실제 3D 세포 모양 그리고 현지화에 관련되는 데이터의 손실로 이끌어 내는 2 차원 (2D) 심상을 초래합니다. 가우시안 곡률(두 주 곡률의 곱)과 같은 특정 모양 매개변수는 2D 이미지가 두 주 곡률을 모두 측정하지 않기 때문에 3D로만 측정할 수 있습니다. 추가적으로, 모든 세포는 구부이근 세포의 설치 및 2D 화상 진찰이 정확하게 이 세포의 모양을 나타내지 않을 수 있습니다 때 평평하게 놓이지 않습니다. 3D로 단백질 국소화를 정확하게 측정하면 단백질의 공간 조절 및 기능을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 3D 세포 모양을 재구성하고 정확하게 단백질을 현지화하기 위해 현미경의 흐림 기능을 사용하는 전방 컨볼루션 기술이 개발되었습니다. 여기서, 정확한 세포 형상을 재구성하고 단백질을 국소화하기 위해 박테리아의 살아있는 세포 이미징을 위한 샘플을 3D로 준비하고 장착하기 위한 프로토콜이 설명된다. 이 방법은 간단한 샘플 준비, 형광 이미지 수집 및 MATLAB 기반 이미지 처리를 기반으로 합니다. 많은 고품질 형광 현미경은 이러한 측정을 위해 간단하게 수정할 수 있습니다. 이러한 셀 재구성은 계산 집약적이며, 필요하지는 않지만 처리량이 많은 계산 리소스에 액세스하는 것이 좋습니다. 이 방법은 여러 세균 종 및 돌연변이, 형광 이미징 양식 및 현미경 제조업체에 성공적으로 적용되었습니다.
Introduction
모든 유형의 세포는 특정 기능에 대한 모양을 조절합니다. 예를 들면, 신경은 혈액 세포와 다르게 모양이고 다른 기능이 있습니다. 유사하게, 세균성 세포는 이 모양의 목적이 항상1,2를알려져 있지 않더라도, 모양 및 크기의 다양한에서 옵니다. 따라서 세균 세포의 모양을 정확하게 결정하는 것이 중요합니다. 설명된 방법은 대부분의 살아있는 또는 고정된 세균 세포의 3D 분석에 적합한 데이터를 수집하는 용이하게 구현된 방법을 보여줍니다.
설명된 방법은 정확하게 견본의 3D 세포 모양을 정확하게 표현하고 이 모양 내의 단백질을 정확하게 현지화하기 위하여 세균성 세포의 3D 심상을 취하는 것을 가능하게 합니다. 전통적인 현미경 검사법은 대장균의돌연변이체 또는 비브리오 콜레라및 헬리코박터와 같은 구부러진 박테리아와 같이 비정상적이거나 비대칭적인 모양이 있는 세포를 공부할 때 문제가 되는 2D 심상을 취합니다. 파일로리. 고해상도 3D 이미지가 이 메서드의 핵심 입력이지만 이 메서드는 해상도가 향상된 이미지를 반환하지 않습니다. 오히려, 이 방법은활성 윤곽과 현미경3의 명백한 흐림 기능을 사용하여 전방 컨볼루션 알고리즘을 사용하여 셀의 3D 표면 좌표와 모양을 재구성합니다(그림1). 대장균4,5,6,7, V. 콜레라8의소설 periskeletal element CrvA, 및 가식성에서 세균 작용 상동성 MreB를 연구하는 데 사용되어 왔다. 헬리코박터 파일로리의바토필린 CcmA9 (그림 2).
단백질의 국소화는 그들의 기능에 대한 통찰력을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 세포 분열에 관여하는 단백질은 일반적으로 미드셀10,11에국한된다. 높은 처리량 연구는 그들의 기능에 대한 통찰력을 얻기의 희망에 박테리아의 모든 단백질을 지역화하기 위해 착수되었습니다12. 불행히도, 이 연구 결과는 2D 화상 진찰및 1D 또는 2D 분석으로, 세포 기하학적 특징에 현지화와 같은 단백질 국소화의 특정 양상을 측정하는 것을 불가능하게 했습니다.
예를 들어, 많은 박테리아의 막대 형상에 필요한 동적 단백질인 MreB는 세포벽 합성의 국소화를 지시하여 작동하도록 가설되고, 그 국소화는 세포벽 합성의국소화를반영한다7,13. 여러 종의 MreB는 기하학적 농축4,6,7,14,15를보여줍니다. MreB와 같은 동적 표면 중합체는 표면의 기하학적 형상을 시간 평균 농축프로파일(16)에 결합할 수 있으며멤브레인(17)에결합하는 것과 관련된 에너지를 최소화함으로써 특정 기하학적구조로 방향을 지정할 수 있다. MreB에 대해 비틀림, 번들링, 굽힘 및 역학의 중요성이 완전히 해결되지는 않았지만 표면의 두 주요 곡률을 정확하게 측정하려면 셀의 전체 3D 표현이 필요합니다. 따라서 단백질이 국소화되는 곡률을 가장 정확하게 측정하기 위해 2D 이미징보다는 3D를 사용하는 것이 우선입니다. 3D 이미징은 2D로 측정할 수 없는 곡률을 계산하여 추정할 필요가 없으며, 비대칭셀18에서정확하지 않을 수 있는 추정치입니다.
세포의 2D 이미징이 더 빠르고 많은 포스트 이미징 계산 작업을 필요로하지 않지만, 3D 이미징은 세포의 보다 정확한 표현뿐만 아니라 2D로 측정 할 수없는 곡률과 같은 표면 특징을 측정 할 수있는 기능을 제공합니다. 따라서 3D 이미징이 일반화됨에 따라 세포 모양과 단백질 국소화에 대한 새로운 통찰력이 가능해질 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 중요한 단계는 고품질 이미지를 획득하는 것입니다. 세포를 올바르게 재구성하려면 셀 위와 아래에 충분한 블러가 있어야합니다. 따라서 촬영 된 z-stack이 충분히 큰 거리를 커버하는 것이 필수적입니다. 이미지 수집 중에 수행된 단계 수를 각 변형에 맞게 조정할 수 있습니다. 예를 들어, rodZ에 대해 삭제된 대장균 세포는 더 넓고, 따라서 야생형 세포보다 더 많은 단계가 필요하며, 따라서 더 먼 거리가 필요하다. 이미지 수집 중에 샘플이 드리프트되면 재구성에 큰 오류가 있을 수 있습니다. 따라서, z-stack 획득 동안 드리프트를 피하기 위해 이미징 전에 현미경과 열 평형에 슬라이드를 두는 것이 중요하다. 세포는 낮은 자동 형광이있는 패드에서 이미지화되어야합니다. 일반적인 LB 배지에서 발견되는 것과 같은 미디어 구성 요소에는 세포를 재구성하려고 할 때 문제를 일으킬 수 있는 자가형광이 있습니다. 재구성 과정은 각 세포에 독립적으로 수행되므로 이미징 패드의 세포 밀도가 중요합니다. 너무 적은 세포는 세포의 충분한 수의 심상을 얻기 위하여 필요로 하는 시간을 증가할 것입니다, 너무 많은 세포는 개별 적인 세포를 쉽게 자르기 위하여 너무 조밀한 화상 진찰 필드 귀착될 것입니다 동안. 모든 셀이 제대로 재구성되지는 않으므로 수집 단계에서 추가 셀을 이미지화해야 하며 통계 분석을 진행하기 전에 모든 출력을 스크리브해야합니다(그림 3).
이 방법의 많은 제한 사항은 기술적입니다. 사용되는 현미경에서 박테리아의 크기 척도에서 광학 절편을 가능하게하기 때문에 높은 수치 조리개 (일반적으로 >1.4)를 가진 목표가 있어야합니다. 또한 현미경은 z 방향으로 작고 정확한 단계를 취할 수있는 압전 단계를 장착해야합니다. 또한, 필요하지는 않지만, 셀을 재구성하는 처리 시간을 단축하기 때문에 이미지 분석 소프트웨어를 실행하기 위해 높은 처리량의 계산 리소스에 액세스하는 것이 좋습니다.
이 방법의 한 가지 개념적 한계는 이미지의 신호 대 잡음 비에 비해 재구성의 부드러움에 가중치를 가중하기 위한 올바른 에너지 스케일을 선택해야 한다는 것입니다. 매개 변수의 선택을 확인하려면, 세포의 크기와 모양은 전송 전자 현미경 (TEM) 또는 원자력 현미경 검사법 (AFM)와 같은 독립적 인 방법을 사용하여 측정되어야한다. 원리의 증거로, 세포의 3D 재구성은 z-정확도(&50 nm) 또는 Xy 정확도(&30 nm)3을테스트하기 위해 TEM 그리드에서 테스트하기 위해 AFM에서 수행되었습니다. 이러한 상관 관계 접근 방식은 시간과 비용이 많이 듭니다. 더 간단한 접근법은 야생형 세포 또는 1 μm 구형 구슬과 같은 표준 샘플을 이미지화하는 것일 수 있다. 재구성의 지름과 구도는 재구성에 사용되는 크기와 에너지 스케일이 올바른지 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
이것은 형광 현미경 심상에서 고해상도 공간 정보를 추출하는 것을 추구하는 유일한 방법이 아닙니다. 많은 리뷰 기사는 초고해상도 현미경 검사법24,25의 분야에서 최근의 발전을 설명합니다. 분해 현미경검사법 (26),회전 디스크 공초점 현미경 검사법27,픽셀 재할당28및 구조화 조명 현미경 검사법 (SIM)29와 같은 해상도 향상 기술은 해상도를 개선하기 위해 노력합니다. 현미경에 의해 취득 된 이미지. 이러한 메서드는 제시된 접근 방식과 호환되지 않습니다. 최근에이 방법은 입력9로SIM 기반 이미지를 허용하도록 조정되었습니다 . 전진 컨볼루션 방법은 그 기초의 일부를 데콘볼루션 현미경 검사법과 공유하지만, 완전히 다른 출력을 가지고 있습니다. 데콘볼루션 현미경 검사법과 같은 접근법은 이미지의 해상도를 개선하기 위해 노력하는 반면, 이 접근법은 이미지를 생성하지 않고 약 50 nm정밀의 세포 형상 재구성을 생성합니다. 드물게 표지된 샘플에 기초한 단일 분자 활성 제어 현미경 기술은 이 방법보다 더 높은 수준의 공간 정밀도를 제공할 수 있습니다. 많은 경우에, 이 단 하나 분자 접근은 형광 구조물의 최적화를 요구하고 살아있는 또는 동적 견본으로 사용하기 어렵게 하는 긴 취득 시간을 요구할 수 있습니다. 이러한 각 메서드에는 이 메서드가 사용하지 않는 하나 이상의 주의 사항이 함께 제공됩니다. 예를 들면, 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 광고되는 이득은 비행기 빛에서 많지 않은 세균성 세포의 단층에게 적용되지 않습니다. 또한, 이 방법은 어떤 특수한 형광단의 필요 없이 정확한 3D 세포 모양 및 단백질 현지화를 취득하는 파이프라인을 제공합니다. 이 방법은 최소한의 하드웨어 요구 사항 (즉, z 압전, 높은 NA 목표)을 가지고 있으며 동적 3D 구조6을쉽게 조사 할 수 있도록 타임 포인트 당 수십 개의 이미지만 필요합니다.
3D 구조물에 있는 세균성 세포의 조직을 공부하는 접근의 증가수가 있었습니다. 이들은 고품질, 3D 형광 이미지30,31,32를활용하는 개념적으로 유사한 접근법을 포함한다. 이 접근은 잘 단리된 세포를 요구하고 셀방식기하에 관하여 더 선행 가정을 하지 않습니다. 그러나, 조밀한 세포 응집체 또는 생물막으로 이동하기 위하여, 세포는 막대 같이 가정됩니다. 이 더 낮은 해상도 보기는 생물막에 있는 세포의 고밀도가 특정 요인의 세포 외 현지화의 분석을 방지하더라도, 아직도 세포의 포장 배열을 조사할 수 있습니다.
미래에는 단일 분자및 광시야 접근법을 이 3D 재구성 기법과 통합하는 프레임워크를 개발하는 것이 흥미로울 수 있습니다. 더욱이, 보다 조밀한 세포 클러스터의 재구성을 허용하기 위해 머신 비전 세분화도구(32)를 사용하여 이러한 전방 컨볼루션 접근법을 포함할 수 있다.
세포가 특정 모양으로 진화한 이유는 세포가 살고 있는 복잡한 환경을 반영해야 하는 복잡한 문제입니다. 세포 모양의 진화와 기능을 이해하려면 이러한 모양을 정확하고 정확하게 측정해야 하며, 이 측정은 이 방법이 제공하는 것입니다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 방법을 개발해 주신 제프리 응우옌과 조슈아 샤비츠에게 감사드립니다.
자금: RMM – NIH F32 GM103290-01A1, BPB – 노화 연구 및 국립 과학 재단 PHY-1734030을 위한 글렌 센터.
Materials
| 50nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
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