Detta arbete förinställda ett avancerat protokoll för att noggrant bedöma tumör lastning genom detektion av gröna fluorescerande protein och bioluminescens signaler samt integration av kvantitativa molekylära detektionsteknik.
Triple-negativ bröstcancer (TNBC) är en aggressiv bröstcancer subtyp med begränsade terapeutiska alternativ. Jämfört med patienter med mindre aggressiva brösttumörer är 5-års överlevnaden för TNBC-patienter 77% på grund av deras karakteristiska läkemedelsresistenta fenotyp och ögonbevarande börda. Mot detta ändamål, murine modeller har upprättats som syftar till att identifiera nya terapeutiska strategier som begränsar TNBC tumör tillväxt och ögonbevarande spridning. Detta arbete beskriver en praktisk guide för TNBC orthotopic modell där MDA-MB-231 bröstcancerceller svävande i en källare membran matris implanteras i den fjärde bröst fett pad, som nära härmar cancer cell beteende hos människor. Mätning av tumörer av bromsok, lung metastasering bedömning via in vivo och ex vivo imaging och molekylära upptäckt diskuteras. Denna modell ger en utmärkt plattform för att studera terapeutisk effekt och är särskilt lämplig för studier av samspelet mellan den primära tumören och distala metastaserande platser.
Ungefär en av åtta kvinnor i USA kommer att utveckla invasiv bröstcancer under sin livstid, och 10%−20% av dessa kvinnor kommer att diagnostiseras med den aggressiva trippelnegativ bröstcancer (TNBC) subtyp. Medan primära skador kan avlägsnas kirurgiskt i de flesta fall, den subkliniska mikrometerastaser och chemoresistance gör det till en svårbehandlad sjukdom. Viktigt, de flesta patienter med ögonbevarande TNBC så småningom återfall, även om de genomgick behandling i ett tidigt skede1. Således, cancer heterogenitet, mikrometastaser, och terapeutisk resistens är tre stora utmaningar som begränsar det framgångsrika kliniska resultatet av TNBC patienter. Därför finns det ett akut behov av att bättre förstå den polymorfa molekylära bakgrunden av TNBC och utveckla effektiva terapeutiska medel som begränsar ögonbevarande sjukdom.
Tumör metastasering är en multistep process där tumörcellen styr och tillskansar sig sin mikromiljö för att främja sin egen spridning via membran nedbrytning och tumör cell fly från den primära lesion, via inträde i (dvs intravasation) och utträde från (dvs extravasation) vaskulaturen, och slutligen anpassning och kolonisering inom distala vävnadssängar2. Djurmodeller har utvecklats för att studera metastasering av bröstcancer, där två metoder vanligen implementeras: direkt blodcirkulationsinjektion och orthotopic implantation. Vanligen används metoder för direkt blodcirkulation injektion inkluderar svans ven injektion, medan andra metoder inklusive direkt hjärt injektion3, direkt hjärninjektion4, och direkt lever injektion5 har också använts. Den direkta blodcirkulationen injektion kallas ofta en konstgjord metastasering modell, vilket är snabbt och enkelt men mindre fysiologiskt korrekt eftersom det kringgår tumör fly från den primära lesion och intravasation6,7,8. Jämfört med direktinsprutningsmodeller tar den ortotoppic bröstcancermodellen längre tid för förekomsten av påvisbara ögonbevarande lesioner i avlägsna organ som lungan, men det är mer fysiologiskt relevant eftersom den nära efterliknar multistep ögonbevarande process som det förekommer hos människor. Viktigt, en 2013 studie9 jämfört svansen ven injektion och ortopic modeller och fann att bröstcancerceller injiceras i svansen venen och de isolerade från lung ögonbevarande skador efter svans ven injektion uppvisade liknande globala gen uttryck profiler. Däremot var den globala genuttrycksprofilen för ortotopiskt injicerade bröstcancerceller dramatiskt annorlunda än för metastaserande lesioner i lunganfalligenhet som härrörde från ortopotopiskt injicerade celler9. Dessa observationer tyder på att den ortotopiska modellen är mer fysiologiskt relevant, eftersom ögonbevarande skador genomgår en urvalsprocess som liknar multistep processen för metastasering som det förekommer hos människor.
Detta arbete beskriver en orthotopic bröstcancer (MDA-MB-231-Luc/GFP) modell i nakna möss som optimerades i vårt laboratorium för bildframställning detektionstekniker samt identifiering av nya biomarkörer och utveckling av riktade kemoterapeutiska medel.
För studien av TNBC hos djur har två murinemodeller utvecklats: MDA-MB-231 humana bröstadenokarcinomceller hos immunkomprometterade möss (dvs. athymiska nakna möss, NSG-möss) och 4T1 hos immun-kompetenta BALB/c-möss. Båda modellerna har sina fördelar. Valet av djurmodell för en studie beror på forskningsmålen. Till exempel är MDA-MB-231-modellen en mänsklig TNBC-cellinje som odlas i immunkomprometterade möss som efterliknar immunsupprimerade patienter med bröstcancer. Å andra sidan, den invasiva fenotyp av orthotopic 4T1 trippel-negativa murine bröstcancerceller i BALB/c möss härmar nära ögonbevarande processen som det sker i steg IV mänskliga bröstcancerpatienter. Till skillnad från den intravenösa cell injektion strategi, mänskliga MDA-MB-231 bröstcancerceller var på samma sätt injiceras i bröst fett pad11,12 i ortoptoppic bröstcancer modell11,13. Ju längre tumörtillväxt och förvärvad ögonbevarande förmåga är mer fysiologiskt relevant, så det är inte en konstgjord metastaserande cancer modell4,14. En sådan spontan metastasering modell härmar nära mänskliga bröstcancer utveckling med undantag för initieringsstadiet. Detta är en avgörande modell för in vivo läkemedelsscreening och terapeutisk effektbedömning vid metastaserande bröstcancer.
Tumör implantation webbplats i musen spelar en avgörande roll för att ge en mikromiljö som upprätthåller tumörtillväxt och val av ögonbevarande fenotyp liknar den som förekommer hos människor. Den proximala lymfkörteln och förekomsten av fettvävnad är de viktigaste faktorerna som påverkar sjukdomsprogressionen av bröstcancer15,16. Hos en mänsklig patient, lymfkörteln och fettvävnad är båda viktiga interagerande faktorer som påverkar malignitet och incidensen av bröstcancer17,18,19. Således kan valet av rätt anatomisk plats för injektionsstället starkt påverka tumörmodellens relevans jämfört med den mänskliga sjukdomen. Denna studie använde den fjärde bröstkörteln som implantationsstället främst på grund av ovannämnda krav och att det är anatomiskt mer tillgängligt och lättare att manipulera.
Olika tumörvolymberäkningsmetoder finns tillgängliga, och en forskare kan välja vad de vill. Algoritmen som valts ut för denna studie är baserad på resultaten av Faustino-Rocha et al., som jämförde olika tumör volym beräkning formler och drog slutsatsen att formeln nedan är den mest exakta20.
Källarmembran matris är en viktig extracellulär matris som används i olika in vitro21 och in vivo22,,23 analyser. Det finns motstridiga rapporter22,24,25 om påverkan av källaren membran matris på xenograft malignitet. Det verkar bara påverka den ursprungliga etableringen av xenograft och har ingen ytterligare effekt på xenograft tillväxt25. För xenograft implantation beskrivs, källaren membran matris blandades med cancerceller för att öka cellen / gel blandning lösning viskositet före implantation. Närvaron av källarmembranmatrisen minskar förlusten av blandningslösning från injektionsstället och håller blandningslösningen vid implantationsstället, vilket ökar enhetligheten hos den implanterade xenograftvolymen.
MDA-MB-231 cellinjen är en malign förevigade mänskliga bröst adenokarcinom cellinje och är ett populärt verktyg i bröstcancer forskning på grund av dess trippel-negativ status. Användningen av dubbla reportrar (luciferas och GFP) cellinje ger större flexibilitet i hanteringen av in vivo och ex vivo imaging. Det är väl etablerat att bioluminescenssignalen har större känslighet, djup detekterbarhet och överlägsen kontrast (signal-brus-förhållande) än GFP-signaler. På grund av detta är det en allmänt använd bildbehandling modalitet för hela kroppen imaging. Tyvärr begränsas bioluminescensdetektering av ett smalt tidsfönster (~15−20 minuter efter luciferininjektion) under vilken signaldetekteringen är linjär. BLI-signalen minskar snabbt när djuren avlivas. Detta blir en experimentell design fråga om många möss behöver avlivas och skörd flera vävnader eller organ krävs. I dessa studier skördades blod av direkt hjärtpunktering, hjärnan, primära tumör, lunga och drabbade lymfkörteln undersöktes i 40 möss. När organen skördades och redo för ex vivo imaging, bioluminescens signalen var omöjlig att upptäcka. Därför är GFP-detektion mer lämplig i dessa situationer. Utsläppet av GFP-signalen är i det synliga området, och vid dessa våglängder är signalabsorptionen på grund av blod (dvs. hemoglobin) betydligt högre. Autofluorescens i det synliga intervallet på grund av NADH, lipopigment och flavins resulterar också i en betydande bakgrund som gör det svårt att skilja mellan en låg nivå GFP-signal och autofluorescens bakgrund. Använda en multispektrala fluorescens bildbehandling strategi i stället för traditionella filter-par imaging och använda spektrala oblandande algoritmer hjälper till att identifiera sann GFP-signal i organ av intresse. Genom att kombinera styrkan hos bioluminescensavbildning i helkroppsin vivo-detektering och multispektrala GFP-avbildning i ex vivo-utvärderingarna av organ/vävnad kan kvantifierbara data maximeras i en stor kohort av möss.
Oavsett vilket tillvägagångssätt som väljs ut för en djurstudie rekommenderas starkt att extrahera allt blod före hämtning av organ/vävnader, särskilt för studier som är inriktade på den metastaserande bördan. Detta protokoll detekterar GFP-signaler från hela blodprover som erhållits från möss (data som inte visas) i den ortoptopiska bröstcancermodellen genom PCR-analyser i realtid. Minimera blodvolymen i organ/vävnader kommer att minska den falska positiva signalen i målorganen.
Sammanfattningsvis är den ortotopiska bröstcancermodellen med MDA-MB-231-Luc/GFP-cellerna en mycket relevant djurmodell som nära efterliknar det mänskliga TNBC-patientens tillstånd. Denna modell är nödvändig för att studera, övervaka och bedöma terapeutisk effekt i en tumör mikromiljö som liknar människor. Användningen av dubbla reporter cellinjer ytterligare förbättrar det praktiska i denna ortoptopediska bröstcancer modell.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna stöd från Intramural Research Program vid National Institutes of Health, National Cancer Institute, Bethesda MD, Cancer and Inflammation Program, och Frederick National Laboratory – Small Animal Imaging Program, Leidos biomedicinsk forskning, Inc, Frederick Maryland, USA.
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |