인간 면역학적 시냅스 이미징

1. 라지 세포를 부착하는 슬라이드 준비 150 μL의 피브로넥틴(100 μg/mL)을 8 마이크로웰 챔버 슬라이드(플라스틱 바닥 챔버 슬라이드)에 넣고 37°C에서 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 이러한 접착 기질은 라지 세포의 결합을 웰 하부(Step 2)로 허용하고, Jurkat 세포(4단계)를 가진 살아있는 접합체의 형성, 및 시간 경과 현미경 캡처(단계 6)를 허용하며, 또한 선택적 파라포름알데히드(PFA) 고정(Step 7)과도 호환된다.참고: 아세톤 고정의 경우, 아세톤이 플라스틱을 용해하기 때문에 섬유넥틴 대신 유리 바닥 챔버 슬라이드와 폴리 L-리신(20 μg/mL)을 사용하십시오. 8 마이크로웰 챔버 슬라이드(1cm2 웰, 300 μL 최대 부피) 또는 이에 상응하는 것은 유연하고 적절한 형식이다. 200 μL 자동 파이펫을 사용하여 피브로넥틴을 흡인하고 부드러운 흔들림으로 2분 동안 200 μL의 PBS로 각각 잘 세척한다. 이 세척을 한 번 더 반복하십시오. 챔버 슬라이드는 4°C에서 1-2주 동안 PBS와 함께 이 단계에서 보관될 수 있다. 2. 챔버 슬라이드에 라지 세포의 접착 및 7-아미노-4-클로로메틸코마린 (CMAC) 라벨링 라지 세포의 사전 배양물인 10 mL의 컨플렉스(1-2 x 106 세포/mL)를 15 mL, V-bottom 튜브로 옮김을 전달한다. 잘 혼합하고 10 μL을 사용하여 Neubauer 챔버 또는 이에 상응하는 세포를 계산합니다. 실온에서 5 분 동안 300 x g에서 나머지 세포를 원심 분리합니다. 상급자 인해 및 폐기. 따뜻한 완전한 배양 배지(RPMI 1640+10% FCS, 2 mM 글루타민, 10 mM HEPES, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토미신)에서 10 6세포/mL의 농도로 세포 펠릿을 부드럽게 다시 중단시키십시오. 아래 방정식을 사용하십시오.[]초기 x V초기 = [최종 x V최종),여기서 [초기 는 초기 세포 농도를 나타내고, V초기 = 세포 현탁액의 초기 부피, []최종 = 최종 셀 농도, V최종 = 세포 현탁액의 최종 부피.참고: 시작 배양의 세포 농도에 따라, 필요 이상으로 더 많은 세포를 수집할 수 있지만 잠재적인 문제를 방지하기 위해 실험이 끝날 때까지 배양(37°C)에서 남은 세포를 유지하는 것이 중요하다(단계 2.6 참조). 라지 세포를 라벨로 시냅스 컨쥬게이트 형성 동안 이들의 식별을 허용한다. 본 실험에서, 7-아미노-4-클로로메틸쿠마린(CMAC) 라벨링은 단계 2.4.2에서 수행된다. 배양 배지에서 필요한 수의 라지 세포를 2 mL 튜브로 이송한다. 8 마이크로웰 챔버 슬라이드의 경우, 총 1.6 mL의 셀 서스펜션이 필요합니다(웰당 200 μL). CMAC가 빛에 민감하기 때문에 최종 농도10 μM에 CMAC를 추가하십시오. 200 μL 2 x 105 Raji 세포는 1 cm2 당 잘 필요하다. 따라서 8개의 웰을 준비해야 하는 경우 1.6 x 106 Raji 셀이 필요합니다.참고: 세포 추적기 파란색으로 라지 세포에 라벨을 붙이면 시냅스 접합체가 형성될 때 Th 세포와 구별됩니다. 이 염료는 PFA 및 아세톤 고정제와 호환되며 추가 면역 형광 절차를 허용합니다. 가벼운 박람회를 피하십시오. CMAC를 가진 풀에서 라지 세포의 표지는 섬유넥틴 코팅된 챔버 슬라이드에 라지 세포의 부착 전에 재서스펜션이어서 다른 웰 들 사이에서 CMAC를 가진 라지 세포의 균일한 라벨링을 보장한다. CMAC 염색 된 세포를 재중단하고, 단계 1.2.에서 챔버 슬라이드에서 PBS의 포부 후, 단계 1.1-1.2에서 제조 된 섬유넥틴 코팅 챔버 슬라이드의 각각의 웰에 세포 현탁액의 200 μL을 전송한다. 챔버 슬라이드를 37°C, 5%CO2에서 30 분-1 시간 동안 배양합니다.참고: 이 단계에서 접착력과 CMAC 라벨링이 동시에 발생하며 시간이 절약됩니다. 라지 세포는 신속하게 침전을 할 것이고, 파종 하기 전에 세포 현탁액에서 균일 한 농도를 유지 하기 위해 주의 해야 합니다. CMAC 세척이 2.7 단계에서 더 쉽게 수행되기 때문에 원심 분리에 의해이 단계에서 CMAC를 씻을 필요가 없습니다 (표지 된 라지 세포가 이미 챔버 슬라이드에 부착된 경우). CMAC는 과도한 세포 현탁액에 존재하기 때문에, 청색 형광 배경이 너무 높아서 청색 염색 된 세포를 구별할 수 없습니다. CMAC 세척 후 2.7단계에서 세포 CMAC 형광을 확인합니다. 라지 세포가 현미경에 챔버 슬라이드의 부드러운 흔들림에 의해 우물의 바닥에 부착되어 있는지 확인합니다. 셀이 서로 사이의 간격을 표시하고 서로 결합되지 않았는지 확인합니다(그림1,가운데 패널). 세포 합류의 50-60%가 적절하다. 대부분의 세포가 챔버 슬라이드에 효율적으로 부착되고 세포 간격이 관찰되지 않으면 따뜻한 완전한 배지로 각 세포를 잘 씻고 200 μL 자동 파이프로 배지를 재중단하여 셀 과잉을 분리하십시오. 각 재서스펜션 단계 후에 합류를 확인합니다. 세포가 부착되지 않으면 접착 단계를 다시 반복하고 접착 시간 및 /또는 셀 수를 늘립니다.참고: 여기서 멈추고 챔버 슬라이드를 37°C, 5%CO2 하룻밤(O/N)에서 배양하고 다음날 프로토콜을 계속 할 수 있습니다. 라지 세포가 형광 현미경 검사법을 사용하여 부착 및 CMAC 표지 남아 있는지 다음 날 확인하시기 바랍니다. 여분의 CMAC를 제거하고 형광 현미경으로 청색 방출을 확인하기 위해 따뜻한 보충 RPMI로 다시 조심스럽게 다시 잘 씻어(그림 1).참고: 침지 오일(끈적거리고 점성) 및 높은 수치 조리개 오일 목표의 사용을 피하기 위해, 초장거리(즉, 20x 또는 40x) 목표를 사용하여 형광 현미경을 사용하여 CMAC 라벨링을 신속하게 확인할 수 있습니다. 3. CMAC의 펄스 — 황색포도상구균 장독소 E를 가진 표지된 라지 세포 황색포도상구균 장독소 E (참조, 1 μg / mL)를 각 우물에 추가하십시오. SEE는 SEE 냉동 스톡(PBS에서 1 mg/mL)으로부터 세포 배양 배지(100 μg/mL의 작업 용액)에서 편리하게 희석될 수 있습니다. 200 μL 마이크로웰당 100x 작동 용액의 2 μL을 사용하십시오.주의 사항: 이 단계에 장갑을 사용하고 사용된 팁을 생물학적 위험 상자에 폐기하십시오. 챔버 슬라이드를 37°C, 5%CO2에서 30분 이상 배양한다. SEE 효과는 적어도 3-4시간 동안 지속됩니다.참고: SEE는 별개의 타임랩스 설정이 계획된 경우(5단계) 및/또는 종점 실험의 시작 시점(6단계)에 따라 필요한 경우 상이한 시점의 웰에 추가할 수 있다. 4. 주캇 세포의 준비 이 실험을 위해 이전에 성장한 Jurkat 세포(1-2 x 106 세포/mL)를 사용하십시오. 앞서 설명한바와같이 표준 배양 플라스크 또는 표준 전기화 프로토콜에 따른 이전 형질감염으로부터 세포를 사용한다. Jurkat 세포의 형질감염은 살아있는 세포에서 분비 과립의 트래픽의 시간 경과 시각화를 허용할 것입니다. 예를 들어, GFP-CD63(MVB의 마커)이 표현되면 GFP-CD63-장식된 소포의 움직임을 기록할 수있다(비디오 1). 상 대비 현미경의 밑에 세포를 관찰하십시오. 죽은 세포의 과잉 (>20-30%) 관찰, 표준 프로토콜(24)을사용하여 Ficoll 밀도 구배 원심 분리를 수행, 죽은 세포의 과잉을 제거하기 위해 (죽은 세포는 살아있는 세포보다 높은 밀도를 나타낸다) 사용하기 전에 (토론 참조). 세포를 15 mL 튜브, V-bottom 튜브로 옮기고 혈세포계를 사용하여 계수하기 위해 10 μL을 사용합니다. 2.2단계에서 기재된 바와 같이 나머지 세포를 원심분리기. 상급체를 버리고 신선하고 따뜻한 배양 배지를 사용하여 라지 세포 (1 x 106/mL)와 동일한 농도로 세포를 다시 중단하십시오. 2.2-2.3 단계를 따릅니다. 4단계를 기다리는 동안 배양체(37°C, 5%CO2)에서Jurkat 세포를 유지한다.참고: 두 번째 옵션 (형질 감염)에서, 살아있는 세포의 수는 첫 번째 보다 훨씬 낮을 것입니다. 따라서, 실험을 위한 충분한 세포를 갖기 위하여 더 높은 시작 세포 배양 량을 사용하는 것을 고려한다. 10 x 106 Jurkat 세포에서 전기 개화 큐벳 및 형질 감염 당, 만 2-4 x 106 Jurkat 세포는 48 시간 의 형질 전환 후 생존하고 이러한 세포 중 일부는 Ficoll 단계 동안 손실됩니다. 따라서, 하나의 전기 천공 큐벳은 일반적으로 8 마이크로 웰 (1.6 x 106 형질 감염된 Jurkat 세포)에서 부착 된 SEE 펄스 라지 세포에 도전하기에 충분하다. 5. 라지와 주캇 세포의 공동 파종 3.2단계에서 인큐베이터로부터 CMAC 표지된, SEE-펄스, 부착된 라지 세포를 함유하는 챔버 슬라이드를 취한다. 이전에 2.7 단계에서 수행되었기 때문에 이 단계에서 CMAC를 세척할 필요가 없습니다. 각 웰의 배양 배지를 하나씩 하나씩 흡인하여, 자동 200 μL 파이펫을 사용하여 웰의 한 구석에서 흡인한다. 잘 된 매체를 완전히 건조시키지 마십시오. 4.5단계에서 제조된 세포 배양 배지(1 x 10 6/mL)에서 재중단된 Jurkat 세포의 200 μL로 배지를 즉시 교체한다. 시간 경과 화상 진찰이 수행되는 경우에, Jurkat 세포가 퇴적하고 시냅스 접합체를 아주 빨리 형성하는 경향이 있기 때문에, 이 단계 직후6단계로 이동하십시오. 편의를 위해, 이 단계에서 Jurkat 세포로 시드를 받지 않는 SEE-펄스, 부착된 라지 세포를 함유하는 마이크로웰은 Jurkat 세포에 대한 후속 도전까지 세포 배양 배지로 유지되어야 한다. 이를 통해 Jurkat 세포에 대한 후속 도전을 유연하게 허용하여 추가 시간 경과 또는 역역학, 종점 실험 접근법을 사용할 수 있습니다. 시간 경과가 수행될 경우 신속하게 6단계로 진행합니다. 이는 시냅스 컨쥬게이트 형성 및 동시 이미지 획득을 허용하도록 37°C, 5%CO2에서 현미경 단계 인큐베이터 또는 이에 상응하는 1-2 시간 동안의 공동 배양을 포함한다. 종점 분석이 없는 경우, 세포를 고정하기 전에 현미경(도 1)을이용하여 공동 배양 기간 후 의 회부 결합체 형성을 예견한다(단계 7). 6. 신흥 시냅스 접합관의 시간 경과 이미징 이미징 전에 현미경과 배양챔버를 준비합니다. 비디오 1에 표시된 예제의 경우 자세한 현미경 설정은 그림 2에표시됩니다.참고: 시간 경과 실험이 계획되는 경우, 모든 현미경 설정 및 보체(주변 세포 배양 챔버 등)는 부착된 라지 세포를 가진 챔버 슬라이드에 Jurkat 현탁액을 첨가하기 전에 제조되어야 한다. 다음 단계는 상업적현미경(물자 표)에대해 설명된다. 그러나, 세포 배양 인큐베이터를 구비한 임의의 반전형광 현미경이 사용될 수 있다. 편광 트래픽을 이미징할 때 60배 오일 침지, 높은 수치 조리개가 있는 현미경을 사용하십시오. 자동 초점 시스템이 켜져 있는지 확인하고 오프셋을 조정하여 하단 표면에 바인딩된 Raji 셀에 초점을 맞춥니다. 그림 1, 비디오 1 및 비디오 2를참조하십시오. 5.3단계에서 부착된 라지 세포를 함유하는 각 웰을 각각 유량첨가한 후, 예열된(1-2시간) 현미경 스테이지 인큐베이터(즉, OKOlab)에서 마이크로웰 챔버 슬라이드를 신속하게 찾아내고 현미경으로 일부 XY 위치를 선택하고, 그 분야는 현미경 초점으로 떨어지는 Jurkat 형질감염세포에 의해 만들어진 신흥 IS 대형을 기록할 가능성이 높습니다. 온도 안정화 단계가 안정적인 X, Y, Z 위치를 유지하는 것이 관찰되었기 때문에 예열된 현미경 단계 인큐베이터를 사용한다. 편리한 XY 필드에 대한 기준은 다음과 같습니다 : 잘 집중되고 비 결합 된 라지 세포 (즉, 세포 간 간격을 표시) 및 형질 감염 Jurkat 세포의 존재 (이것은 투과 및 UV 또는 GFP 채널을 결합하여 확인할 수 있습니다). Jurkat 세포는 챔버 슬라이드에 매우 빠르게 (몇 분) 침전하고, 신흥 시냅스를 이미지 할 수있는 기회는 시간이 지남에 따라 감소할 것이다(그림 1). 정의된 시간 경과 후 실험을 완료하거나 7단계로 진행하여 후속 면역형광 및 분석을 위해 접합체를 고칠 수 있다.참고: 적절한 시간 해상도(프레임당 1-2분)로 동시, 다중 웰 타임랩스 수집을 위해 최대 4개의 서로 다른 마이크로웰에서 최대 16개의 서로 다른 현미경 필드를 선택할 수 있습니다. 제한은 이미지화될 다양한 형광화의 수와 강도(카메라 박람회에 영향을 미치는)에 의존합니다(CMAC를 제외한 발현형 단백질의 수에 따라 다름). 프레임 속도를 높이는 한 가지 방법은 GFP에 대한 각 “n” 시간 프레임 중 하나만으로 CMAC 채널에 대해 기록하는 것입니다(즉, n=8, 도 2에도시된 바와 같이), 라지 셀이 잘 바닥에 부착되고 Jurkat 세포로서 쉽게 이동하지 않기 때문에. 또한, 이것은 빈번한 UV 광 노출이 세포를 손상시킬 수 있기 때문에, 세포 생존을 유익합니다. MVB의 편광을 완료하는 데 몇 분에서 몇 분 정도 걸리기 때문에 시간 프레임 속도를 1분 이하(즉, 비디오 1, 도 2의프레임당 20초)로 조정해 보십시오. 전동 에피 형광 포탑과 적절한 밴드 패스 형광 필터 또는 등가물을 갖춘 현미경은 이 다중 채널 캡처를 수행하는 데 필요합니다. 7. 시냅틱 접합선 및 고정의 종점 형성 엔드포인트 실험만 이 계획된 경우(시냅스 접합체 형성이 적절하다는 것을 허용하기 위해 1-2시간 배양), 챔버 슬라이드를 37°C에서 배양하고, 1-2h에 대해 5%CO2를 배양하고, 배양 기간 후 컨쥬게이트 형성을 확인(도 1에서와같이) 이어서, 아세톤 또는 PFA로 접합체를 고정(후속 면역에 사용되는 항원 및 항출체에 의존한다). 이 경우 인큐베이션은 현미경 단계 인큐베이터를 필요로 하지 않는다. 예를 들어 비디오 3을 참조하십시오. 세포를 고치려면 FCS없이 따뜻한 RPMI (37 °C) 배지로 부드럽게 흔들어서 잘 씻어 내보소소(세럼의 알부민는 아세톤 고정물로 침전될 수 있음). 흡입하고 각각의 우물에 PFA 또는 미리 냉각 된 아세톤의 200 μL을 추가합니다. 챔버 슬라이드를 실온(RT) 또는 얼음위에 각각 20분 동안 배양합니다.참고: 아세톤 고정을 위해 아세톤을 -20°C에서 미리 식히고 챔버 슬라이드를 4°C에서 미리 식힙니다. 아세톤이 8 개의 유리 바닥 챔버 슬라이드에서 배양 된 세포를 고정하는 데 사용되는 경우 플라스틱 뚜껑을 제거하십시오. PBS로 각 우물을 두 번 세척하고 담금질 용액 (PBS, 50 mM NH4Cl)의 200 μL을 추가합니다. 챔버 슬라이드를 4 °C에서 배양합니다.참고: 이 단계에서 챔버 슬라이드는8에기재된 바와 같이 면역형광 프로토콜을 수행하기 전에 4°C에서 적어도 1개월 동안 머물 수 있다. 뚜껑은 증발을 방지합니다. 8. 이미지 처리 시간 경과 시리즈 및 / 또는 고정 된 세포의 스틸 사진의 수집 후 이미지 디톤 볼루션 (즉, Huygens deconvolution 또는 동등한, 재료의 표)를수행합니다. 적절한 소프트웨어(즉, Huygens의 “와이드 필드” 광학 옵션 사용)와 올바른 광학 파라미터를 사용하여 Deconvolute를 사용합니다. 현미경4의 측정점 확산 함수(PSF)의 이미지 처리를 위해 데선볼루션이 필요합니다. 또는, 현미경 파일에서 메타 데이터 중 포함 된 광학 매개 변수의 자동 로드에 의해 이상화 된 PSF를 계산하는 소프트웨어를 사용합니다. 이러한 광학 파라미터는 불소파장, 굴절률, 목표의 수치 개구부 및 이미징 기술(공초점, 광시야 등)을 포함한다. 4. 그 후, 이미징 소프트웨어는 PSF 및 다양한 데코볼루션 알고리즘(즉, Huygens 소프트웨어의 QMLE 및 CMLE)을 단계별 축적, 계산 프로세스에서 사용하며, 그 결과 사용자는 필요할 때 지속적으로 시각화및 중지(또는 재개)할 수 있다. 이 단계에서 사용자는 회선 및 / 또는 신호 대 잡음 비를 변경하고 deconvolution을 다시 시작할 수 있습니다. deconvolution 소프트웨어는 타임랩스 시리즈 (X, Y, T)(비디오 2)및 Z 스택 (X, Y, Z)(비디오 3)와잘 작동합니다. 세포질, 확산 형광화는4,9에의해 개선되지 않기 때문에, 디콘볼루트 채널은 이후 CMAC, 원시 채널에 병합되었다.