成像人类免疫学突触

1. 准备幻灯片以粘附拉吉细胞 将每口井中150 μL的纤维素（100μg/mL）加入8微井室滑动（塑料底室滑动），并在37°C下孵育30分钟至1小时。这种粘附基板将允许Raji细胞结合到井底（步骤2），与Jurkat细胞（步骤4）细胞形成活体结合，以及延时显微镜捕获（步骤6），并在之后与可选的甲醛（PFA）固定（步骤7）兼容。注：对于丙酮固定，使用玻璃底室幻灯片和聚L-流水（20微克/mL），而不是纤维蛋白，因为丙酮溶解塑料。8 微井室滑动（1 厘米2井，最大体积 300 μL）或等效物是灵活和适当的格式。 使用 200 μL 自动移液器吸气纤维化，用 200 μL 的 PBS 清洗每个井 2 分钟，轻轻摇动。再重复一次。在此阶段，腔室滑块可在 4°C 下与 PBS 一起存储 1-2 周。 2. 拉吉细胞粘附在室幻灯片和7-氨基-4-氯甲基胆素（CMAC）标签上 将 Raji 细胞的预培养（1-2 x10 6 细胞/mL）的 10 mL 转移到 15 mL V 底管中。混合良好，使用10μL计算Neubauer腔室或等效细胞。 在室温下，在300 x g下将剩余的细胞离心5分钟。吸气并丢弃上清液。 在暖完整培养基中轻轻重新悬浮细胞颗粒（RPMI 1640辅以10S、2 mM谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素），浓度为106细胞/mL。使用下面给出的公式：（* 起始x V初始= ==最终的 x V最终），其中 =初始表示初始细胞浓度，V初始= 细胞悬浮的初始体积，=最终= 最终细胞浓度，V最终= 细胞悬浮的最终体积。注：根据起始培养基的细胞浓度，可以收集超过所需细胞的细胞，但重要的是将培养基中剩余的细胞（37°C）保持到实验结束，以防止潜在的问题（参见步骤2.6）。 标记 Raji 细胞，以便在突触结合形成期间进行识别。在本实验中，步骤2.4.2中执行7-氨基-4-氯甲基古马林（CMAC）标签。 将培养基中的拉吉细胞数量转移到 2 mL 管中。对于 8 微孔室滑动，总共需要 1.6 mL 的电池悬架（每孔 200 μL）。 将CMAC添加到10μM的最终浓度中。由于CMAC对光敏感，因此用铝箔覆盖管，使细胞保持在黑暗中。每 1 厘米2井需要包含 2 x 105拉吉细胞的 200 μL。因此，如果需要准备8口井，则需要1.6 x 106 Raji细胞。注：使用细胞跟踪器蓝色（CMAC、紫外线激发和蓝色发射）标记Raji细胞，在形成突触结合时，使其与Th细胞区别开来。这种染料与PFA和丙酮固定剂兼容，允许进一步的免疫荧光程序。尽量避免轻的阐述。在带有CMAC的池中标记Raji细胞，然后重新悬浮，然后将拉吉细胞粘附到纤维素涂层室幻灯片上，确保不同井间具有CMAC的Raji细胞的均质标记。 重新悬浮CMAC染色细胞，并在从步骤1.2的腔室滑动中吸入PBS后，将200μL的细胞悬浮液转移到步骤1.1-1.2中制备的纤维素涂层腔室滑道的每个孔。在 37°C 下孵育腔室滑动，5% CO2，30分钟-1 小时。注：粘附和 CMAC 标签将在此步骤中同时出现，从而节省时间。请注意，Raji 细胞会迅速沉淀，在播种前，需要谨慎，以保持细胞悬浮液中的均匀浓度。现阶段无需通过离心清洗 CMAC，因为 CMAC 洗涤在步骤 2.7 中更容易完成（当标记的 Raji 细胞已粘附在腔室幻灯片上时）。由于CMAC存在于细胞悬浮量中，过量存在，蓝色荧光背景过高，无法区分蓝染色细胞。在 CMAC 洗涤后检查步骤 2.7 中的细胞 CMAC 荧光。 通过在显微镜上轻轻摇动腔室滑动，确保 Raji 细胞粘附在井底。确保单元格之间显示间隙且不汇合（图 1，中间面板）。50-60%的细胞汇合是适当的。 如果大多数细胞有效地粘附在腔室滑动上，并且没有观察到细胞间隙，则用暖完整的介质清洗每个孔，用200μL自动移液器重新悬浮介质以分离细胞过剩。在每个重新悬浮步骤后检查汇合。 如果细胞不粘附，重复粘附步骤，增加附着力时间和/或细胞数。注：可以在这里停止，在37°C，5%CO2过夜（O/N）孵育腔室滑动，并在第二天继续执行协议。请在第二天确认Raji细胞保持粘附状态，并使用荧光显微镜贴上CMAC标签。 再次用热补充 RPMI 小心清洗每个井，以消除多余的 CMAC，并使用荧光显微镜检查蓝色排放（图1）。注：为了避免使用浸入油（粘性和粘性）和高数值孔径油物，可以使用超长距离（即 20x 或 40x）物镜使用荧光显微镜快速检查 CMAC 标签。 3. CMAC的脉搏 – 贴有葡萄球菌肠毒素 E 的 Raji 细胞 在每个井中添加葡萄球菌肠毒素E（SEE，1微克/mL）。SEE 可在细胞培养基（工作溶液在 100 μg/mL）中从 SEE 冷冻液（PBS 中为 1 mg/mL）中方便地稀释。每200μL微井使用100倍工作溶液的2μL。警告：此步骤使用手套，并将用过的尖端放入生物危害箱中。 在 37°C、5% CO2下孵育腔室滑动至少 30 分钟。SEE 效果至少持续 3-4 小时。注：如果需要，如果计划不同的延时设置（步骤 5）和/或根据结束点实验的开始时间点（步骤 6），可以在不同时间点将 SEE 添加到井中。 4. 朱尔卡特细胞的制备 在此实验中，使用以前生长的Jurkat细胞培养（1-2 x 106细胞/mL）。使用来自标准培养瓶的电池或以前根据标准电穿孔协议进行转染的细胞，如前所述23。Jurkat细胞的转染将允许活细胞中分泌颗粒的分泌物流量的时移可视化。例如，当GFP-CD63（MVB的标记）表示GFP-CD63修饰囊泡的运动可以记录（视频1）。 在相对比显微镜下观察细胞。如果死细胞过多（>20-30%）观察，使用标准协议24执行Ficoll密度梯度离心，以消除死细胞（死细胞比活细胞密度更高）在使用前过剩（参见讨论）。 将细胞转移到15 mL管V底管，并使用10 μL使用血细胞计进行计数。 如步骤 2.2 所述，使剩余的细胞离心。使用新鲜、温暖的培养基，丢弃上清液并重新悬浮与Raji细胞（1 x 106/mL）相同的浓度。按照步骤 2.2-2.3 操作。 在等待步骤 4 时，在培养基中保持 Jurkat 细胞（37 °C，5% CO2）。注：在第二个选项（转染）中，活细胞的数量将大大低于第一个选项。因此，考虑使用较高的起始细胞培养量，以便有足够的细胞进行实验。从 10 x 106 Jurkat 细胞每个电穿孔和转染， 只有 2-4 x 106 Jurkat 细胞将生存后 48 h 转染和其中一些细胞将丢失在 Ficoll 步骤.因此，一个电穿孔的二甲子通常足以挑战8个微孔（需要1.6 x 106转染Jurkat细胞）的粘附的SEE脉冲拉吉细胞。 5. 拉吉和朱尔卡特细胞的共同播种 从步骤 3.2 中，将包含 CMAC 标记、SEE 脉冲、粘附拉吉细胞的腔室幻灯片从培养箱中拿出来。在此阶段无需清洗 CMAC，因为以前在步骤 2.7 中这样做。 使用自动 200 μL 移液器，从井的一角小心地吸出每口井的培养基。不要让井中的介质完全干燥。 立即用步骤 4.5 中制备的细胞培养基 （1 x 10 6 /mL） 中重新悬浮的 Jurkat 细胞 （1 x 106/mL） 替换该培养基。如果执行时差成像，请立即执行此步骤步骤 6，因为 Jurkat 细胞往往会沉淀并很快形成突触结合。为方便起见，含有SEE脉冲、粘附的Raji细胞的微孔在此阶段未接受Jurkat细胞的播种，应使用细胞培养基维持，直到随后对Jurkat细胞提出质疑。这将灵活地允许随后的挑战与Jurkat细胞额外的时间推移或反向动力学，终点实验方法。 如果要执行时间间隔，请快速执行步骤 6。这涉及在显微镜阶段培养箱上共培养1-2小时，或在37°C，5%CO2，允许突触共聚形成和同时图像采集。如果端点分析，但没有时间推移，则在固定细胞之前（步骤7）之前，使用显微镜（如图1）在共培养期后检查共培养形成。 6. 新兴突触偶联的时移成像 在成像前准备显微镜和孵育室。对于视频 1 中显示的示例，详细的显微镜设置如图2 所示。注：如果计划进行时移实验，则应在将 Jurkat 悬架添加到带有粘附 Raji 细胞的腔室滑块之前，准备所有显微镜设置和补充（环境细胞培养室等）。商用显微镜（材料表）描述了以下步骤。然而，可以使用任何配备细胞培养箱的倒置荧光显微镜。 成像偏振流量时，使用具有 60 倍油浸、高数值孔径的显微镜。 确保自动对焦系统已打开并调整偏移以对连接到底部表面的 Raji 单元。请参阅图1、视频 1和视频 2。 在 Jurkat 在步骤 5.3 中加入包含粘附的 Raji 细胞的每个井后，快速在预热的（1-2 h） 显微镜级培养箱（即 OKOlab）上定位微井室幻灯片，并选择一些 XY 位置，即其位于可能记录一个新兴的IS形成，例如，一个Jurkat转染的细胞落入显微镜焦点。 使用预热显微镜级培养箱，因为观察到温度稳定阶段保持稳定的X，Y，Z位置。方便的 XY 字段的标准是：聚焦良好且未融合的 Raji 细胞（即，显示细胞之间的间隙）和转染的 Jurkat 细胞的存在（这可以通过结合透射和 UV 或 GFP 通道进行检查）。Jurkat细胞会非常迅速地（几分钟）沉积在腔室幻灯片上，并且图像出现突触的机会会随着时间而减少（图1）。有可能在规定的时间间隔后完成实验，或者继续步骤7，并修复结合物，以便进行后续的免疫荧光和分析。注：可以从多达 4 个不同的微井中选择多达 16 个不同的显微镜场，以适当的时间分辨率（每帧 1-2 分钟）进行同步多井延时采集。限制取决于要成像的各种荧光铬的数量和强度（影响相机的展示）（取决于表达的荧光蛋白的数量，除了CMAC）。提高帧速率的一种方法是记录 CMAC 通道在 GFP 的每个”n”时间帧中的一个（即 n = 8，如图2所示），因为 Raji 细胞粘附在井底，并且不会轻易作为 Jurkat 细胞移动。此外，这有利于细胞的生存能力，因为频繁的紫外线照射可能会损害细胞。尝试将时间帧速率调整到每 1 分钟或更少 1 帧（即视频 1中每帧 20 秒，图 2），因为 MVB 的极化需要几分钟到几小时才能完成。配备电动表氟炮塔和适当的带通荧光过滤器或等效器的显微镜是执行这种多通道捕获所必需的。 7. 突合和固定的终点形成 如果只计划进行端点实验（1-2 小时孵育，允许突触结合形成是适当的），在 37°C 孵育腔室滑动，5% CO2进行 1-2 小时。 在这种情况下，孵育不需要显微镜级培养箱。有关示例，请参阅视频 3。 要修复细胞，请用不带FCS的温暖RPMI（37°C）介质轻轻摇动洗井（血清中的白蛋白可能沉淀丙酮固定）。吸气，并在每口井中加入200 μL的PFA或预冷却丙酮。分别在室温 （RT） 或冰上孵育室滑动 20 分钟。注：对于丙酮固定，在-20°C前冷却丙酮，在4°C时预冷室滑动。当丙酮用于固定 8 口井玻璃底室幻灯片中培养的细胞时，请取下塑料盖。 用PBS清洗每口井两次，并加入200μL的淬火溶液（PBS，50 mM NH4Cl）。在 4°C 下孵育造型室滑动。注：在此阶段，室滑块可在4°C下至少停留一个月，然后执行免疫荧光方案，如描述8所述。盖子防止蒸发。 8. 图像处理 执行延时序列和/或固定单元的静止照片的采集后图像去卷积（即惠更斯去卷积或等效材料表）。通过采用适当的软件（即，在惠更斯中使用”广域”光学选项）和正确的光学参数来进行解说。去卷积需要显微镜4的测量点扩散函数（PSF）的图像处理。 或者，使用该软件通过自动加载显微镜文件中的元数据中包含的光学参数来计算理想化的PSF。这些光学参数包括荧光铬波长、折射率、物位数值孔径和成像技术（共聚焦、宽场等）4. 随后，成像软件在一步一步的累积计算过程中使用PSF和多种反卷积算法（即惠更斯软件中的QMLE和CMLE），其结果比用户需要时可以连续可视化和停止（或恢复）。在此阶段，用户可以更改卷积和/或信噪比的数量，并恢复反卷积。去卷积软件与时差系列 （X，Y，T） （视频 2）和 Z 堆栈 （X，Y，Z） （视频 3） 配合良好。脱脂通道随后被合并到CMAC，原始通道，因为细胞，漫射氟铬没有改善的去卷积4，9。