Un modello di ratto preclinico per lo studio delle lesioni ischemia-reperfusione in microchirurgia ricostruttiva

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con il comitato etico del Centro di Chirurgia Minimamente Invasiva di Jesès Usàn e le linee guida di benessere del governo regionale che si basano sulla legislazione europea. 1. Preparazione prechirurgica e chirurgica I ratti Wistar di casa del peso di 290-350 g in gabbie a 22-25 gradi centigradi con libero accesso al cibo e all’acqua. Acclimatare per 1 settimana prima dell’intervento chirurgico per prevenire problemi indotti dallo stress. Mettere un ratto in una camera di induzione anestetica, fornire 5 min di ossigeno (0,5-1 L/min), e utilizzare un vaporizzatore per fornire il 5% di sevoflurane per indurre l’anestesia. Togliere il topo dalla camera una volta indotta l’anestesia. Posizionare la maschera facciale per inalazione sul ratto e fornire una portata del 2% di sevoflurane per mantenere l’anestesia. Verificare la mancanza di risposta a un pizzico di punta. Utilizzare un unguento di protezione degli occhi per prevenire l’essiccazione corneale e danni. Monitorare l’animale in anestesia generale come segue: Posizionare un termometro rettale (35,9–37,5 gradi C), controllare il colore della membrana mucosa e posizionare un ossimetro a impulsi del roditore per verificare la saturazione Di2 (>95%) frequenza cardiaca (250-450 bpm). Utilizzare un supporto termico (pastiglie di riscaldamento elettrico o coperte d’acqua circolanti) per evitare l’ipotermia e migliorare il recupero dell’anestesia post-procedurale. Iniettare 5 mL di soluzione salina fisiologica sottocutanea calda per mantenere una corretta idratazione. Fornire antibiotici analgesici e antinfiammatori (meloxicam 1 mg/kg/giorno) e antibiotici profilattici (enrofloxacin 7,5 mg/kg/giorno) sottocutanea prima della procedura e per 5 giorni postoperatori. Rasare le aree addominali e inguinali dell’animale. Applicare il povidone-iodio topico, seguito dal 70% di etanolo. Coprire l’animale con un drappo sterile. 2. Chirurgia modello flap pelle gratuita Utilizzando un marcatore chirurgico, disegnare un lembo di 3 cm x 6 cm che corrisponda a uno dei lati di 6 cm con la linea mediana dell’addome. Successivamente, fare un’incisione della pelle di 6 cm alla linea mediana dell’addome e due incisioni perpendicolari di 3 cm nella parte superiore e inferiore dell’incisione mediana di 6 cm. Per iniziare a sezionare il lembo della pelle di 3 cm x 6 cm, utilizzare le forbici e le pinze Adson per sollevare il lembo (piuttosto che un bisturi) a causa della mobilità della pelle. Tirare delicatamente il lembo dall’area cranica verso l’area caudale per aiutare con la dissezione e identificare il pedicolo epigastrico circondato dall’abbondante tessuto connettivo sciolto. Dissezionare il piedicle del lembo senza toccarlo o afferrando l’avventizione il meno possibile per evitare di danneggiare la parete del vaso. Utilizzare suture di nylon 8/0 per occlude per legature i vasi femorali caudali prossimali, vasi femorali circonflli laterali e vasi saphenous. Di seguito, la perfusione del lembo è fornita dall’arteria femorale e continua direttamente attraverso l’arteria epigastrica caudale superficiale, mentre il drenaggio venoso viene eseguito dalla vena epigastrica caudale superficiale verso la vena femorale. Bloccare il pedicolo vascolare e poi tagliarlo per iniziare il periodo di ischemia 8 h. Durante la procedura utilizzare coperte elettriche per mantenere la temperatura. Due iniezioni da 5 ml di soluzione salina calda (25oC) 0,9% sono somministrate sottocutaneamente. La prima somministrazione viene eseguita 2 h dopo l’inizio della procedura; e il secondo alla fine della procedura per ottenere un adeguato recupero dell’animale. Utilizzare la soluzione salina eparinizzata (100 U/mL) per perfondere il lembo e rimuovere il sangue stagnante dalla microcircolazione. Utilizzare suture di nylon 10/0 per eseguire le anastomosi microchirurgiche. Dopo 8 h di ischemia, reperfusione il lembo rimuovendo i morsetti microvascolari e controllare la patenza vascolare come descritto di seguito. 3. Valutazione intraoperatoria Eseguire un test di papotenza manuale (vuoto e test di ricarica) per la vena e l’arteria. Per fare questo, utilizzare due pinze microchirurgiche, posizionarle a distale all’anastomosi ed eseguire la mungitura. Rilasciare prima le pinze più vicine al sito di anastomosi. Se il flusso sanguigno continua dopo lo svuotare una sezione vascolare, allora l’anastomosi è brevetto. Valutare il flusso sanguigno utilizzando un flowmetro ad ultrasuoni a tempo di transito e sonde microchirurgiche. Misurare il diametro dei vasi di pedicle al fine di scegliere la dimensione corretta per le sonde di flusso. NOT:</ Una sonda di flusso da 0,7 mm può misurare vasi che vanno da 0,4 mm a 0,7 mm; una sonda di flusso da 1,0 mm può misurare vasi che vanno da 0,7 mm a 1,0 mm; una sonda di flusso da 1,5 mm può misurare recipienti che vanno da 1,0 mm a 1,5 mm. Posizionare il recipiente bersaglio nella finestra di rilevamento ad ultrasuoni (tra il riflettore e il trasduttore) della sonda di flusso per quantificare il volume di flusso. NOT:</ Tenere la sonda neutra al piano della nave, per evitare qualsiasi tensione o trazione. Controllare la qualità dell’accoppiamento acustico osservando che tutte le barre sono verdi sul display. NOT:</ Se è difficile ottenere un buon accoppiamento acustico, utilizzare il gel ad ultrasuoni o la soluzione salina fisiologica topicamente. Quando si raggiunge un buon accoppiamento e la nave viene posizionata nella finestra acustica senza alcuna tensione, fare clic sul pulsante Registra sul display per memorizzare i dati. NOT:</ Per ottenere una misurazione affidabile e corretta, assicurarsi che il modello di forma d’onda sia costantemente ripetibile. Una volta fatto, utilizzare l’acido poliglicolico (PGA) 4-0 aspirazioni intrecciate assorbibili (16mm 3/8 ago triangolare) per chiudere la pelle. Utilizzare un semplice modello interrotto per mantenere la forza e la posizione del tessuto se parte della sutura viene morsa dal ratto postoperatorio. Valutare la microcircolazione del lembo utilizzando l’analisi del contrasto di macchie laser (LASCA). Effettuare una nuova registrazione per ogni animale e per ogni follow-up dello studio. A tale scopo, fare clic su File/Nuova registrazione. Si apre una nuova finestra e viene visualizzato il pannello di configurazione. Modificare quindi le informazioni relative al nome del progetto, all’oggetto, all’operatore e al nome della registrazione. Per la massima riproducibilità, standardizzare i seguenti parametri: distanza di lavoro, area di misurazione, densità in punti, frequenza fotogrammi e condizioni di luce ambientale. Regolare la distanza di lavoro spostando il laser in relazione al tessuto. Ingrandire o ridurre la testa del laser verso il tessuto di interesse. Per verificare il valore misurato, fare clic su Impostazione immagine. Qui, impostato a 12,0 cm. Standardizzare l’area di misurazione immettendo la larghezza e l’altezza desiderate in Impostazioni immagine. Il lembo progettato misura 3 cm x 6 cm. Per questa misura, selezionare una larghezza di 4,0 cm e un’altezza di 7,0 cm per avere un po ‘di spazio in più. Impostare la densità del punto su alta in Imposta immagine. Alto, medio e basso sono le tre opzioni. Al momento dell’impostazione acquisizione immagine, selezionare la Frequenza fotogrammi (10 immagini/i) per la registrazione e la durata (1 min) della registrazione. NOT:</ Avere la stessa condizione di luce ambientale nella sala operatoria durante l’esecuzione o l’esecuzione delle valutazioni. Fare clic sul pulsante Registra per avviare la registrazione. Il pannello di configurazione viene sostituito dal pannello di registrazione. I dati vengono salvati automaticamente. Creare istantanee durante la procedura per consentire un ulteriore confronto. NOT:</ La scala di perfusione può essere modificata per migliorare la visualizzazione (fare clic su Strumenti Filtri e scale di colori Scala di perfusione Manuale 0 – 150), ma i valori di perfusione misurati non saranno influenzati. Prima e dopo la registrazione, è possibile creare diverse regioni di interesse (ROI) per misurare la perfusione al loro interno. Qui, abbiamo valutato solo l’area del lembo praticato (3 cm x 6 cm). Utilizzare il software ImageJ per misurare la sopravvivenza e le aree di necrosi. Individuare un righello sul lato del lembo e quindi scattare foto di controllo per le misurazioni macroscopiche dell’area di sopravvivenza del lembo. Per valutare le immagini, aprire l’interfaccia utente ImageJ. Fare clic su File e aprire l’immagine da misurare. Selezionare Linea retta nella casella degli strumenti e disegnare una linea retta su 1 cm del righello. Fare clic su Analizza Impostare Scala e introdurre nella casella di testo per la distanza nota il valore di 1 cm. Fare clic sullo strumento Selezione poligono e disegnare le linee del poligono sul lembo per calcolare l’area vitale. In definitiva, fare clic su Analizza Misurare per ottenere il valore dell’area. Posizionare una medicazione postoperatoria sull’animale prima dell’alloggiamento per prevenire l’automutilazione dell’area chirurgica. Al termine delle procedure, gli animali vengono alloggiati in gabbie singolarmente, in una stanza con controllo della temperatura (da 22 a 25 gradi). 4. Valutazione postoperatoria e campionamento dei tessuti Anestesizzare il ratto a 7 giorni postoperatori per la valutazione del lembo e il campionamento dei tessuti seguendo gli stessi passaggi descritti in precedenza in questo protocollo (passaggi 1.2 e 1.3). Controllare la profondità dell’anestesia per la mancanza di risposta al pizzico della punta. Fotografare l’area chirurgica per consentire misurazioni macroscopiche delle aree di sopravvivenza e necrosi del lembo. Effettuare le misurazioni macroscopiche postoperatorie seguendo gli stessi passaggi della valutazione intraoperatoria che sono stati spiegati in precedenza nel protocollo (passaggio 3.5). NOT:</ Prestare attenzione durante l’utilizzo dello strumento Selezione poligono disegnando le linee sul lembo delimitando l’area vitale (misurata in cm2). La percentuale dell’area vitale può essere calcolata come (cm2 dell’area vitale/cm2 dell’area totale del lembo) – 100. Valutare la microcircolazione del lembo utilizzando la tecnica LASCA (passaggio 3.4) per visualizzare e quantificare le differenze di perfusione Dopo l’analisi macroscopica, rimuovere le suture 4/0 e salire il lembo per rivalutare il flusso sanguigno del pedicolo vascolare utilizzando l’ecografia del tempo di transito. Eseguire il campionamento dei tessuti longitudinalmente dividendo il lembo in due parti di 1,5 cm x 6 cm. Immergere una parte in un contenitore di biopsia con 4% di paraformaldeide a temperatura ambiente per ulteriori analisi istologiche. Introdurre l’altra parte del tessuto in un tubo di crioconservazione, immergerlo in azoto liquido e poi crioconservare il tubo conservandolo a -80 gradi centigradi per future analisi molecolari. Eutanasia del ratto in anestesia di inalazione generale utilizzando una rapida iniezione intracardiaca di 2 M KCl/kg secondo le raccomandazioni del comitato etico.