מודל מפרה קליני לחקר איסכמיה-reperfusion פציעה במיקרו-כירורגיה משחזרת

כל ההליכים נערכו בהתאם לוועדה אתית של האיז Usón כירורגיה פולשנית מרכז והנחיות הרווחה של הממשלה האזורית המבוססים על חקיקה אירופית. 1. הכנה פרכירורגית וכירורגית חולדות בית Wistar במשקל 290 – 350 g בכלובים ב 22 – 25 ° צ’ עם גישה חופשית למזון ולמים. Acclimate במשך שבוע לפני הניתוח כדי למנוע בעיות המושרה לחץ. מניחים חולדה בתא אינדוקציה הרדמה, לספק 5 דקות של חמצן (0.5-1 L/דקות), ולהשתמש מכשיר אידוי כדי לספק 5% סקופאנה כדי לגרום להרדמה. תוציא את העכברוש מהחדר. ברגע שההרדמה מושרה מניחים את מסיכת האינהלציה על החולדה ומספקים קצב זרימה של 2% סבלאנה כדי לשמור על ההרדמה. בדוק את חוסר התגובה לצביטה בבוהן. השתמש משחה הגנה עין כדי למנוע ייבוש ונזק הקרנית. נטר את בעל החיים בהרדמה כללית כדלקמן: מקום מד חום רקטלי (35.9 – 37.5 ° c), לבדוק את צבע קרום רירי, ומיקום אוקסימטר מכרסם הדופק כדי לבדוק את הרוויה O2 (> 95%) וקצב הלב (250 – 450 bpm). השתמש בתמיכה בחום (כריות חימום חשמלי או שמיכות מים במחזור) כדי למנוע היפותרמיה ולשפר התאוששות הרדמה פוסט פרוצדורליים. להזריק 5 מ ל של תמיסת מלוחים העורית חם תת עורי כדי לשמור על החות הנכונה. לספק תרופות משכך כאבים ואנטי דלקתיות (מלוקסיאם 1 מ”ג/ק”ג/יום) ואנטיביוטיקה מניעתי (enrofloxacin 7.5 mg/ק”ג/יום) תת-עורי לפני ההליך ובמשך 5 ימים הפוסט. גלח את שטחי הבטן והחיים של החיה. החל povidone אקטואלי-יוד, ואחריו 70% אתנול. כסו את החיה. עם כיסוי סטרילי 2. חינם עור כנף ניתוח מודל באמצעות סמן כירורגי, לצייר 3 ס”מ x 6 ס מ כנף התאמת אחד 6 ס מ הצדדים עם הבטן באמצע הקו. הבא, לעשות חתך העור 6 ס מ על קו האמצע של הבטן ושני שני חתכים הניצב 3 ס”מ בחלק העליון והתחתון של החתך 6 ס מ באמצע. כדי להתחיל לבתר את הכנף המתוכננת 3 ס”מ x 6 ס מ העור, להשתמש במספריים מלקחיים Adson להעלות את הכנף (ולא אזמל) בשל התנועה של העור. בעדינות למשוך את הכנף מאזור הגולגולת לכיוון אזור caudal כדי לעזור עם הניתוח ולזהות את מוקפת ברקמת החיבור שופע רופף. לנתח את הכנף מבלי לגעת בו או לתפוס את האדואדטיה מעט ככל האפשר כדי למנוע פגיעה בקיר כלי הקיבול. השתמש 8/0 התפרים ניילון כדי לעקוף על ידי ליגטורות כלי הירך האבודל הטוב ביותר, לרוחב כלי הירך, ואת כלי saphenous. ובכך, הפרזיה של הכנף מסופק על ידי עורק הירך וממשיך ישירות דרך העורק השטחי האפידלי השטחית, בעוד שניקוז הורידים מבוצע על ידי הווריד השטחי האפידלי השטחית לכיוון וריד הירך. הדק את כלי הדם ולאחר מכן גזור אותו כדי להתחיל את תקופת איסכמיה 8 h. במהלך ההליך להשתמש שמיכות חשמליות כדי לשמור על טמפרטורה. שתי זריקות של 5 מ ל חם (25 ° c) 0.9% תמיסת מלח הם מנוהלים תת-עורי. המינהל הראשון מבוצע 2 שעות לאחר תחילת ההליך; והשניה בסוף ההליך להשגת החלמה נכונה של בעל החיים. השתמש בתמיסת המלח heparinized (100 U/mL) כדי להפעיל את הכנף ולהסיר את הדם הקפואה מן המיקרו מחזור. השתמש 10/0 התפרים ניילון לבצע מיקרו כירורגי. לאחר 8 שעות של איסכמיה, לבצע מחדש את הכנף על ידי הסרת מהדק מיקרוכלי דם ולבדוק את הפנסיה כלי הדם כמתואר להלן. 3. הערכה מבצעית ביצוע מבחן הפנסיה ידני (מבחן ריק ומילוי) עבור הווריד והעורק. כדי לעשות זאת, להשתמש בשני מלקחיים מיקרוכירורגית, למקם אותם באמצע החיבור ולבצע את החליבה. שחררו את הלקחיים הקרובים. ביותר לאתר ההשקה קודם אם זרימת הדם ממשיכה אחרי שחלק כלי הדם מתרוקן, אז ההשקה היא פטנט. העריכו את זרימת הדם באמצעות מעבר flowmeter אולטרסאונד ובדיקות מיקרו ניתוחי. למדוד את קוטר כלי העוקץ כדי לבחור בגודל המתאים לבדיקות הזרימה.הערה: בדיקה זרימת 0.7 מ”מ יכול למדוד ספינות החל מ 0.4 מ”מ עד 0.7 מ”מ; בדיקה זרימת 1.0 מ”מ יכול למדוד ספינות החל מ 0.7 מ”מ עד 1.0 מ”מ; בדיקה זרימת 1.5 מ”מ יכול למדוד ספינות החל מ 1.0 מ”מ עד 1.5 מ”מ. מניחים את כלי היעד בחלון חישה אולטרה סאונד (בין מחזיר האור ואת התמרה) של בדיקה זרימת לכמת את עוצמת הזרימה.הערה: החזיקו את המקדח נייטרלי למישור הספינה, כדי להימנע ממתח או משיכה. בדוק את איכות הצימוד האקוסטי על-ידי התבוננות כי כל הסורגים הם ירוקים על הצג.הערה: אם קשה לקבל צימוד אקוסטי טוב, השתמש ב-אולטראסוניות ג’ל או תמיסת מלוחים למריחה על המידה. כאשר מושגת זיווג טוב והכלי מוצב בחלון האקוסטי ללא כל מתח, לחץ על לחצן הרשומה בתצוגה כדי לאחסן את הנתונים.הערה: כדי להשיג מדידה אמינה ונכונה, ודא כי תבנית צורת הגל היא לשחזור באופן תמידי. פעם עשיתי, להשתמש בחומצה פוליגליקולית (PGA) 4-0 הנספג תפר קלוע (16mm 3/8 משולש מחט) כדי לסגור את העור. השתמש דפוס פשוט הפריעו לשמור על מיקום החוזק והרקמה אם חלק התפר הוא ננשך על ידי החולדה העכבר. להעריך את המיקרוסירקולציה של הכנף באמצעות ניתוח ניגודיות מיוחד לייזר (LASCA). בצע הקלטה חדשה עבור כל חיה ועבור כל מעקב של המחקר. בשביל זה, לחץ על קובץ/הקלטה חדשה. נפתח חלון חדש ומוצג לוח ההתקנה . לאחר מכן ערוך את המידע של שם הפרוייקט, הנושא, האופרטור וההקלטה. לקבלת מיקום מירבי, יש לתקנן את הפרמטרים הבאים: מרחק עבודה, אזור מדידה, צפיפות נקודות, קצב מסגרות ותנאי תאורת סביבה. כוונן את מרחק העבודה על-ידי הזזת הלייזר ביחס לרקמה. התקרבות או התרחקות של ראש הלייזר לעבר רקמת הריבית. כדי לבדוק אם הערך שנמדד, לחץ על הגדרת תמונה. כאן, ממוקם ב 12.0 ס מ. תקנן את אזור המדידה על-ידי הזנת הרוחב והגובה הרצויים בהגדרת התמונה. המדף המעוצב מודד 3 ס”מ x 6 ס”מ. עבור מדידה זו, בחר רוחב של 4.0 ס מ וגובה של 7.0 ס מ כדי לקבל קצת שטח נוסף. הגדר את צפיפות הנקודות כגבוהה בהגדרת התמונה. גבוהה, בינונית ונמוכה הן שלוש האפשרויות. בתוכנית ההתקנה של לכידת התמונות, בחר את קצב המסגרות (10 תמונות/s) עבור ההקלטה והמשך (1 דקות) של ההקלטה. הערה: יש את אותו מצב תאורת סביבה בחדר הניתוח תוך כדי הפעלה או ביצוע ההערכות. לחץ על לחצן הרשומה כדי להתחיל בהקלטה. לוח ההתקנה מוחלף בלוח ההקלטה. הנתונים נשמרים באופן אוטומטי. צלם תמונות במהלך ההליך כדי לאפשר השוואה נוספת.הערה: ניתן לשנות את קנה המידה הפרפיוז כדי לשפר את ההדמיה (לחץ על כלים | מסננים וסולמות צבע | סולם פרפיוז ‘ ן | ידני 0-150), אך ערכי זלוף נמדד לא יושפעו. לפני ואחרי ההקלטה ניתן ליצור אזורים שונים של עניין (ROIs) כדי למדוד את הפרזיה בתוכם. כאן, אנו העריכו רק את האזור של הכנף התאמן (3 ס”מ x 6 ס מ). השתמש בתוכנת ImageJ כדי למדוד את אזורי ההישרדות והנמק. אתר סרגל בצד הכנף ולאחר מכן קח תמונות שליטה עבור מדידות מאקרוסקופי של אזור הישרדות המדף. כדי להעריך תמונות, פתח את ממשק המשתמש ImageJ. לחץ על קובץ ופתח את התמונה למדידה. בחרו קו ישר בארגז הכלים וציירו קו ישר מעל 1 ס מ של הסרגל. לחץ על לנתח | קבעו את קנה המידה והציגו בתיבת הטקסט את הערך של 1 ס מ. לחצו על הכלי בחירת מצולע וציירו את קווי המצולע מעל הכנף כדי לחשב את האזור הבר-קיימא. בסופו של דבר, לחץ על לנתח | מדידה לקבלת ערך האזור. הניחו הלבשה פוסט-ניתוחית על בעל החיים לפני הדיור כדי למנוע השחתה עצמית של האזור הכירורגי. לאחר ההליכים, בעלי החיים ממוקמים בכלובים בנפרד, בחדר עם בקרת טמפרטורה (22 ° c עד 25 ° c). 4. הערכה שלאחר ניתוח ודגימת רקמה באמצעות שלבים שתוארו בפרוטוקול זה (צעדים 1.2 ו-1.3), הייתה החולדה בשבעה ימים לאחר הניתוח ודגימת רקמות. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר התגובה צביטה הבוהן. לצלם את האזור כירורגי כדי לאפשר מדידות מאקרוסקופי של הישרדות כנף ושטחים נמק. הפוך את המדידות המאקרוסקופיות שלאחר הניתוח בעקבות אותם צעדים של ההערכה התוך-אופרטיבית שהוסברו לפני בפרוטוקול (שלב 3.5).הערה: שימו לב בזמן שאתם משתמשים בכלי בחירת המצולע על-ידי ציור הקווים בכנף שתוחם את האזור הבר-קיימא (שנמדד ב-cm2). האחוז של האזור קיימא ניתן לחשב כמו (ס מ2 של שטח קיימא/ס”מ2 של שטח המדף הכולל) × 100. הערכת מיקרו מחזור של הכנף באמצעות טכניקת lasca (שלב 3.4) כדי להמחיש ולכמת הבדלים זלוף לאחר ניתוח מאקרוסקופי, להסיר את התפרים 4/0 ולעלות את הכנף כדי להעריך מערכת משוב את זרימת הדם המעברה בדם באמצעות אולטרסאונד בזמן המעבר. לבצע דגימת רקמה על ידי longitudinally חלוקת הכנף לשני חלקים של 1.5 ס”מ x 6 ס”מ. לטבול חלק אחד במיכל ביופסיה עם 4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורת החדר לניתוח היסטולוגית נוספת. להציג את החלק השני של הרקמה בצינור הקפאה, לטבול אותו בחנקן נוזלי ולאחר מכן, הקפאה קריוגנית הצינור על ידי אחסונם ב-80 ° c עבור ניתוחים מולקולריים עתידיים. המתת חסד החולדה תחת הרדמה שאיפת כללית באמצעות הזרקה מהירה של 2 מ ק ג/ק”ג על פי המלצות הוועדה האתית.