5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리
Summary
이 프로토콜의 목표는 lissencephalic 및 gyrencephalic 척추동물의 중추 신경계의 여러 영역에서 미세 혈관을 분리하는 것입니다.
Abstract
중추 신경계 (CNS)에서 미세 혈관의 분리는 일반적으로 여러 동물, 가장 자주 설치류에서 피질 조직을 결합하여 수행됩니다. 이 접근은 피질에 혈액 두뇌 방벽 (BBB) 속성의 심문을 제한하고 개별적인 비교를 허용하지 않습니다. 이 프로젝트는 여러 CNS 영역에서 신경 혈관 단위 (NVU)의 비교를 허용하는 격리 방법의 개발에 초점을 맞추고: 피질, 소뇌, 광학 엽, 시상 하부, 뇌하수체, 뇌간, 및 척수. 더욱이, 원래 뮤린 견본을 위해 개발된 이 프로토콜은, 우리가 또한 두뇌 반구 백색 물질에서 microvessels를 격리할 수 있는 작고 큰 척추동물 종에서 CNS 조직에 사용을 위해 성공적으로 적응되었습니다. 이 방법은, 면역 표지와 결합될 때, 개별, 조직 모형, 또는 처리 사이 단백질 발현 그리고 통계적인 비교의 정량화를 허용합니다. 우리는 신경염증성 질환, 다발성 경화증의 뮤린 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 동안 단백질 발현의 변화를 평가함으로써 이러한 적용성을 입증했습니다. 또한, 이 방법으로 분리된 마이크로혈관은 qPCR, RNA-seq 및 웨스턴 블롯과 같은 다운스트림 애플리케이션에 사용될 수 있습니다. 이것은 초원심분리 또는 효소 해리를 사용하지 않고 CNS 마이크로 혈관을 분리하려는 첫 번째 시도가 아니지만 단일 개인 및 다중 CNS 영역의 비교에 대한 숙련도가 독특합니다. 따라서, 그것은 그렇지 않으면 모호한 남아있을 수있는 차이의 범위의 조사를 허용: CNS 부분 (피질, 소뇌, 광학 엽, 뇌간, 시상 하부, 뇌하수체, 척수), CNS 조직 유형 (회색 또는 백색 물질), 개인, 실험 치료 그룹, 및 종.
Introduction
우리의 뇌는 우리 몸에서 가장 중요한 기관입니다. 이러한 이유로, 정상에서 편차를 일으킬 수 있는 외부 요인에도 불구 하 고 뇌 항상성을 유지 하는 것이 우선 순위. 일부 학자에 따르면, 약 400-5억 년 전1,척추 동물은 우리가 지금 혈액 뇌 장벽으로 알고 개발 (BBB)2,3. 이 보호 “울타리”는 혈액과 CNS 자렌 치마 사이의 이온, 분자 및 세포의 수송을 엄격하게 조절하여 중추 신경계 (CNS) 항상성 및 기능에 가장 큰 영향을 미칩니다. BBB가 중단되면 뇌는 독성 노출, 감염 및 염증에 취약해집니다. 따라서, BBB 기능 장애는 많은 연관, 전부는 아니지만, 신경 및 신경 발달 장애4,5,6.
BBB의 정교한 기능은 신경 혈관 단위 (NVU)2,3에의해 부합하는 독특한 CNS 미세 혈관 구조에 기인한다. 고도로 전문화된 내피 세포, 회구 및 성상 세포 끝피트는 NVU2,3의세포 성분이다. 이들 세포에 의해 생성된 세포외 기matrix는 또한 NVU 및 BBB 생리학2,3에필수적이다. NVU의 필수 세포 및 분자 성분이 척추동물 사이에서 보존되지만, 이질성은 주문 및 종7,8사이에서 보고된다. 그러나, 기술적 한계는 신경 생물학, 생물 의학, 또는 번역 연구에 있는 이 다름을 완전히 고려하는 우리의 기능을 방해합니다.
이 때문에, 우리는 물고기, 양서류, 파충류, 조류 및 포유류 : 우리는 모든 다섯 척추 동물 그룹에서 수많은 종에 적용 할 수 있도록 CNS 지역 별 마이크로 혈관 격리 방법을 확장했다. 이 프로토콜은 번역 관련성이 있는 종을 포함하는 작은 계수뇌증 및 큰 자뇌척추동물에 사용하기 위해 기술된다9. 추가적으로, 우리는 이 문맥 내의 전에 조사되지 않은 CNS의 그밖 지구를 포함합니다, 그러나 신경 생리학및 엄청난 임상 연루와 관련있는: 시상 하부, 뇌하수체 및 백색 물질. 마지막으로, 우리는 NVU 및 / 또는 BBB9,10,11을따라 단백질 발현의 변화를 식별하는 신뢰할 수있는 도구로이 격리 방법의 용량을 테스트했습니다. 개념 증명으로서, 우리는 면역형광에 이어 격리 방법을 사용하여 EAE 동안 VCAM-1 및 JAM-B 발현의 변화를 결정하는 방법을 보여주었다.
Protocol
본 연구의 모든 절차는 캘리포니아 대학 (UC), 데이비스 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설정 된 지침에 따라. UC 데이비스의 동물 보호는 여러 독립적 인 자원에 의해 규제되며 1966 년부터 실험실 동물 관리 국제 (AAALAC)의 평가 및 인증 협회에 의해 완전히 인증되었습니다. 돼지 CNS 조직은 동물 과학의 UCD 학과에서 얻은, 육류 과학 연구소. rhesus 원숭이에서 CNS 조직은 캘리포니아 국립 영?…
Representative Results
뮤린 CNS로부터 분리된 미세혈관은 신경혈관 단위2,3의모든 내재세포 성분을 보였다. 내피 세포에 대한 혈소판 내피 세포 부착 분자-1 (PECAM, CD31이라고도 함) 또는 isolectin IB4 (내피 세포 글리코칼릭스를 결합하는 당단백질)를 사용하여, 혈소판 유래 성장 인자 β(PDGFRβ) 또는 신경-신경교 항원 2(NG2)는 성상 세포종말피트를 위한 구혈…
Discussion
BBB는 CNS 항상성에 중요한 단단한, 부착-, “페그 소켓”- 접합부 및 CNS 항상성에 중요한 접착 플라크의 정교한 아키텍처에 의해 결합된 뇌 미세 혈관 내피 세포의 독특한특성을포함한다2,3,19. 내피 세포 특성은 주위 세포및 주변 아스트로글리아 말발 공정2,3,19에</su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
크루즈 오렌고 박사는 캘리포니아 대학, 데이비스, 수의학 창업 기금의 학교에 의해 지원되었다.
Materials
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
Referencias
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Citar este artículo
Yuan, Y., Dayton, J. R., Freese, M., Dorflinger, B. G., Cruz-Orengo, L. Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups. J. Vis. Exp. (155), e60291, doi:10.3791/60291 (2020).