Bakteriell peptid display för val av nya Biotinylating enzymer

Biotinylation av ett protein skapar en kraftfull tagg för dess tillhörighet isolering och detektion. Enzymatisk proteinbiotinylering är en mycket specifik posttranslationell modifiering som katalyseras av biotin-proteinligaser. E. coli biotin-proteinligase bira är ytterst specifik och kovalent biotinylates endast ett begränsat antal naturligt förekommande proteiner vid specifika lysin rester¹. Fördelarna med bira katalyseras biotinylation är för närvarande utnyttjas genom att fixera målproteinet med en liten syntetisk 15-Amino-Acid biotin acceptor peptid (AP) som effektivt en² och möjliggör den mycket specifika och effektiv in vivo-och in vitro-biotinylering genom samtidig Expression eller tillsats av bira^3,4,5. Även om in vivo och in vitro BirA katalyseras biotin-proteinligering är en attraktiv märknings strategi, dess tillämpning är begränsad till prover som innehåller AP-smält proteiner. Syftet med denna metod är utvecklingen av nya mutanter av biotin-proteinligaser som selektivt biotinylate infödda oförändrade proteiner och därmed utöka antalet tillämpningar där den enzymatiska biotinylation strategi kan användas.

Protein funktion kan utvecklas genom iterativa rundor av genmutation, urval, och förstärkning av genvarianter med önskad funktion. En stark och effektiv urvals strategi är avgörande för den riktade evolutionen och biotin-proteinligasaktiviteten är lätt utvald på grund av den starka bindningen mellan biotin och konjugerat och dess homologs⁶. Fagdisplayteknik möjliggör val av Fager som visar en peptider^7,8. Eftersom amplifiering av isolerade Fager kräver infektion av en bakteriell värd, emellertid, den fagselektion med konjugerat skapar en flaskhals i att hög affinitet bindningen av biotin till konjugerat är praktiskt taget oåterkallelig under icke-denaturering Villkor. För att säkerställa reversibel bindning av biotinylerade Fager, monomer avidins med lägre affinitet användes som resulterade i en blygsam ~ 10-faldig anrikning⁷. Vi utvecklade nyligen en bakteriell visningsmetod för isolering av nya BirA varianter som eliminerar behovet av eluering från affinitetsmatrisen och därmed tar bort en flaskhals från tidigare BirA urvalssystem⁹. Faktum är att vårt bakteriella displaysystem möjliggör en > 1, 000, 000-faldig anrikning av aktiva kloner i ett enda urval steg⁹, vilket ger ett effektivt urvalssystem för den riktade utvecklingen av nya bira-varianter.

Vårt bakteriella displaysystem består av två komponenter, bira med en C-Terminal 6xhis tag och ett byggnadsställning protein som gör det möjligt för ytan visning av en mål peptid. Vi använde byggnadsställning protein förstärkt cirkulärt perdämpad yttre membranprotein X (ecpx) eftersom effektiv visning av peptider kan observeras vid både N-och C-Termini^10,11. Fusionen av målet peptid sekvens till C-terminus eCPX säkerställer biotinylation av bakterier som uttrycker aktiva BirA varianter. Bakterierna tillåter det effektiva konjugerat urvalet som en peptid visar nu på ytan (figur 1a).

Syftet med denna metod är att välja för nya varianter av BirA att biotinylates peptid sekvenser som finns i inhemska proteiner. Systemet kodas av gener som finns på plasmid pBAD-BirA-eCPX-AP, som innehåller en arabinose-inducerbar promotor som kontrollerar BirA (araBAD), och en T7-promotor som kontrollerar eCPX⁹ (figur 1b). Det nuvarande protokollet beskriver det detaljerade förfarandet för 1) införlivande av en peptid som härrör från ett målprotein i C-terminalen i ecpx, 2) skapandet av ett Mutations bibliotek av bira av felbenägna PCR, 3) val av streptavidin-bindande bakterier genom magnetisk aktiverad cell sortering (Mac), 4) kvantifiering av bakterie anrikning, och 5) initial karakterisering av isolerade kloner.