Pantalla de péptido sinábicos para la selección de nuevas enzimas biotinylantantes
Summary
Aquí presentamos un método para seleccionar nuevas variantes de la E. coli biotin-protein ligase BirA que biotinyla un péptido objetivo específico. El protocolo describe la construcción de un plásmido para la visualización bacteriana del péptido objetivo, la generación de una biblioteca BirA, la selección y caracterización de variantes BirA.
Abstract
La biotina es una atractiva modificación post-traduccional de proteínas que proporciona una potente etiqueta para el aislamiento y detección de proteínas. La biotinylación enzimática por la E. coli biotin-protein ligase BirA es muy específica y permite la biotinylación de proteínas diana en su entorno nativo; sin embargo, el uso actual de biotinilación mediada por BirA requiere la presencia de un péptido aceptador sintético (AP) en la proteína diana. Por lo tanto, su aplicación se limita a las proteínas que han sido diseñadas para contener el AP. El propósito del presente protocolo es utilizar la visualización bacteriana de un péptido derivado de una proteína diana no modificada para seleccionar las variantes de BirA que biotinylates el péptido. El sistema se basa en un único plásmido que permite la co-expresión de variantes BirA junto con un andamio para la visualización de péptidos en la superficie bacteriana. El protocolo describe un procedimiento detallado para la incorporación del péptido objetivo en el andamio de la pantalla, la creación de la biblioteca BirA, la selección de variantes de BirA activas y la caracterización inicial de las variantes aisladas de BirA. El método proporciona un sistema de selección altamente eficaz para el aislamiento de nuevas variantes BirA que se pueden utilizar para la evolución más dirigida de ligasas biotina-proteína que biotinylan una proteína nativa en soluciones complejas.
Introduction
La biotinylación de una proteína crea una etiqueta poderosa para su aislamiento y detección de afinidad. La biotinylación de proteínas enzimáticas es una modificación post-traduccional altamente específica catalizada por ligasas de biotina y proteína. La E. coli biotin-protein ligase BirA es extremadamente específica y covalentemente biotinyla sólo un número restringido de proteínas de origen natural en residuos específicos de lisina1. Las ventajas de la biotinilación catalizada por BirA se aprovechan actualmente fusionando la proteína diana con un pequeño péptido sintético de 15 aminoácidos que acepta la biotina (AP) que se biotintiza eficazmente2 y permite el altamente específico y biotinylación eficiente in vivo e in vitro por coexpresión o adición de BirA3,4,5. Aunque la ligadura biotina-proteína catalizada in vivo e in vitro de BirA es una estrategia de etiquetado atractiva, su aplicación se limita a muestras que contienen proteínas fusionadas con AP. El propósito de este método es el desarrollo de nuevos mutantes de ligasas biotina-proteína que biotinylan selectivamente proteínas nativas no modificadas y, de este modo, ampliar el número de aplicaciones en las que se puede utilizar la estrategia de biotintinación enzimática.
La función proteica se puede evolucionar a través de rondas iterativas de la mutación genética, selección y amplificación de variantes genéticas con la función deseada. Una estrategia de selección fuerte y eficiente es crucial para la evolución dirigida y la actividad de la ligasa de proteína sin biotina se selecciona fácilmente debido a la fuerte unión entre la biotina y la estreptavidina y sus homólogos6. Las tecnologías de visualización de Phage permiten la selección de fagos que muestran péptidos biotinilados7,8. Dado que la amplificación de fagos aislados requiere la infección de un huésped bacteriano, sin embargo, la selección del fago con estreptavidina crea un cuello de botella en el que la unión de alta afinidad de biotina a la estreptavidina es prácticamente irreversible bajo la no desnaturalización Condiciones. Para garantizar la unión reversible de fagos biotinilados, se utilizaron ávidinas monoméricas con menor afinidad que dieron lugar a un modesto enriquecimiento de10veces 7 . Recientemente hemos desarrollado un método de visualización bacteriana para el aislamiento de nuevas variantes BirA que elimina la necesidad de la elución de la matriz de afinidad y por lo que elimina un cuello de botella de los sistemas de selección BirA anteriores9. De hecho, nuestro sistema de visualización bacteriana permite un enriquecimiento de 1.000.000 de clones activos en un solo paso de selección9,proporcionando así un sistema de selección eficaz para la evolución dirigida de las nuevas variantes BirA.
Nuestro sistema de visualización bacteriana consta de dos componentes, BirA con una etiqueta C-terminal 6xHis y una proteína de andamio que permite la visualización superficial de un péptido objetivo. Utilizamos la proteína andamio mejorada circularmente permutada proteína de membrana externa X (eCPX) ya que la visualización efectiva de péptidos se puede observar tanto en el N- y C-termini10,11. La fusión de la secuencia de péptidos diana con el Término C de eCPX asegura la biotinilación de bacterias que expresan variantes activas de BirA. Las bacterias permiten la selección efectiva de la estreptavidina, ya que el péptido biotintilado ahora se muestra en la superficie(Figura 1a).
El propósito de este método es seleccionar para nuevas variantes de BirA que biotinylates secuencias de péptidos presentes en proteínas nativas. El sistema está codificado por genes presentes en el plásmido pBAD-BirA-eCPX-AP, que contiene un promotor inducible de arabinosa que controla BirA (araBAD), y un promotor T7 que controla eCPX9 (Figura 1b). El presente protocolo describe el procedimiento detallado para 1) la incorporación de un péptido derivado de una proteína diana en el terminal C de eCPX, 2) la creación de una biblioteca mutacional de BirA mediante PCR propensa a errores, 3) selección de bacterias de unión a la estreptavidina por clasificación celular activada magnéticamente (MACS), 4) cuantificación del enriquecimiento de bacterias y 5) caracterización inicial de clones aislados.
Protocol
Representative Results
Discussion
En cuanto a todos los métodos de selección, la rigela de los pasos de lavado es de suma importancia. Dado que las bacterias no necesitan ser eluted de las perlas antes de la amplificación de los clones seleccionados, la alta afinidad de unión entre la biotina y la estreptavidina se puede utilizar en lugar de utilizar ávidanos de menor afinidad, como se hizo anteriormente con el sistema de visualización de fago, para la selección de las variantes BirA7,8. E…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Mohamed Abdullahi Ahmed la asistencia de los técnicos expertos. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Lundbeck, la Fundación Novo Nordisk, la Asociación Danesa del Riñón, la Fundación Aase og Ejnar Danielsen, la Fundación A.P. M’ller para el Avance de la Ciencia Médica, y Knud y Edith Eriksen Fundación Memorial.
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
Referencias
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