Бактериальный пептидный дисплей для выбора новых биотинилатирующих ферментов

Биотинилация белка создает мощный тег для его изоляции сродства и обнаружения. Биотинилация ферментативного белка является весьма специфической посттрансляционной модификацией, катализированной биотин-белковыми лигазами. E. coli биотин-протеина лигаза BirA является чрезвычайно специфическим и ковалентно биотинилатов только ограниченное количество естественных белков на конкретных остатков лизина¹. Преимущества катализированной биотиниляции BirA в настоящее время используются путем сплавления целевого белка с небольшим синтетическим 15-аминокислотным биотином пептида (AP), который эффективно биоинтиниляции² и позволяет высокоспецифические и эффективное in vivo и in vitro биотинилация путем совместного выражения или добавления BirA^3,4,5. Хотя in vivo и in vitro BirA катализируют сяврин-белковую перевязку является привлекательной стратегией маркировки, ее применение ограничено образцами, содержащими слитые AP белки. Целью этого метода является разработка новых мутантов биотин-белковых лигазов, которые избирательно биотинилат местные неизмененные белки и, тем самым, расширяют количество применений, в которых может быть использована ферментативная стратегия биоинжиниляции.

Белковая функция может развиваться с помощью итеративных раундов генной мутации, выделения и усиления вариантов генов с желаемой функцией. Сильная и эффективная стратегия отбора имеет решающее значение для направленной эволюции и биотин-протеиновой лигазной активности легко подобрана из-за сильной связывания между биотином и стрептавидином и его омологами⁶. Технологии фаги позволяют подбирать фаги, которые отображают биотинилатные пептиды^7,8. Поскольку усиление изолированных фагов требует заражения бактериального хозяина, однако, выбор фага стрептавидинсоздает узкое место в том, что высокородность связывания биотина стрептавидин практически необратимым под не-денатурация Условия. Для обеспечения обратимого связывания биотининатированных фагов использовались мономерные алдины с более низким сродством, что привело к скромному обогащению^в10 раз. Недавно мы разработали метод бактериального дисплея для изоляции новых вариантов BirA, который устраняет необходимость в elution из матрицы сродства и тем самым удаляет узкое место из предыдущих систем отбора BirA⁹. В самом деле, наша бактериальная система отображения позволяет для 1000000 раз обогащение активных клонов в одном шаге отбора⁹, таким образом, обеспечивая эффективную систему отбора для направленной эволюции романа BirA вариантов.

Наша бактериальная система отображения состоит из двух компонентов, BirA с C-терминал 6xHis тег и эшафот белка, что позволяет для поверхности отображения целевого пептида. Мы использовали эшафот белка расширения круговой пермутированный наружной мембраны белка X (eCPX), так как эффективное отображение пептидов можно наблюдать как на N- и C-терминини^10,11. Слияние целевой пептидной последовательности с C-термином eCPX обеспечивает биотинилацию бактерий, выражающих активные варианты BirA. Бактерии позволяют для эффективного выбора стрептавидина, как биотинилаповый пептид теперь отображается на поверхности(Рисунок 1a).

Цель юаней – отобрать для новых вариантов BirA, которые биотинилатируют пептидные последовательности, присутствующие в местных белках. Система кодируется генами, присутствующими на плазмидном pBAD-BirA-eCPX-AP, который содержит арабинос-индуцированный промоутер, контролирующий BirA (araBAD), и промоутер T7, контролирующий eCPX⁹ (Рисунок 1b). Настоящий протокол описывает детальную процедуру для 1) включения пептида, полученного из целевого белка, в C-терминал eCPX, 2) создание мутационной библиотеки BirA по подверженным ошибкам ПЦР, 3) выбор стрептавидиновых бактерий сортировка клеток с магнитным активированным (MACS), 4) количественная оценка обогащения бактерий и 5) первоначальная характеристика изолированных клонов.