Bakteriel peptid-display til udvælgelse af nye Biotinylerende enzymer

Biotinylering af et protein skaber en kraftfuld tag for sin affinitet isolation og detektion. Enzymatisk protein biotinylering er en meget specifik post-translationel modifikation katalyseret af biotin-protein-ligaser. E. coli biotin-protein Ubiquitinligase BirA er yderst specifik og kovalent biotinylater kun et begrænset antal naturligt forekommende proteiner ved specifikke lysinrester¹. Fordelene ved BirA katalyseret biotinylering udnyttes i øjeblikket ved at fusing målproteinet med en lille syntetisk 15-aminosyre biotin acceptor peptid (AP), der effektivt er biotinyleret² og giver mulighed for den meget specifikke og effektiv in vivo-og in vitro-biotinylering ved co-ekspression eller tilsætning af BirA^3,4,5. Selvom in vivo og in vitro-katalyseret biotin-protein ligering er en attraktiv mærknings strategi, er dens anvendelse begrænset til prøver, der indeholder AP-smeltet proteiner. Formålet med denne metode er at udvikle nye mutanter af biotin-protein-ligaser, der selektivt biotinylerer indfødte umodificerede proteiner og derved udvider antallet af anvendelser, hvor den enzymatiske biotinyleringstrategi kan anvendes.

Protein funktionen kan udvikles gennem iterativ runder af genmutationen, udvælgelsen og amplificeringen af genvarianter med den ønskede funktion. En stærk og effektiv udvælgelses strategi er afgørende for den instruerede evolution og biotin-protein ubiquitinligase aktivitet er let udvalgt på grund af den stærke binding mellem biotin og streptavidin og dens homologer⁶. Phage display Technologies giver mulighed for udvælgelse af fager, der viser biotinylerede peptider^7,8. Da forstærkning af isolerede fager kræver infektion af en bakteriel vært, men fagtypning udvælgelse med streptavidin skaber en flaskehals i, at den høje affinitet binding af biotin til streptavidin er næsten irreversibel under ikke-denaturering Betingelser. For at sikre reversibel binding af biotinylerede fager blev der anvendt monomeriske avidiner med lavere affinitet, hvilket resulterede i en beskeden ~ 10-fold berigelse⁷. Vi har for nylig udviklet en bakteriel visningsmetode til isolering af nye BirA varianter, der eliminerer behovet for eluering fra Affinity matrix og dermed fjerner en flaskehals fra tidligere BirA udvælgelsessystemer⁹. Faktisk giver vores bakterielle display system mulighed for en > 1, 000, 000-fold berigelse af aktive kloner i et enkelt valg trin⁹, hvilket giver et effektivt udvælgelsessystem for den rettede udvikling af nye BirA varianter.

Vores bakterielle display system består af to komponenter, BirA med en C-Terminal 6xHis tag og et stillads protein, der giver mulighed for overfladen visning af et mål peptid. Vi brugte stilladset protein forbedret cirkulært permuteret ydre membran protein X (eCPX), da den effektive visning af peptider kan observeres på både N-og C-Termini^10,11. Den fusion af Target peptid sekvens til C-endestation af eCPX sikrer biotinylering af bakterier, som udtrykker aktive BirA varianter. Bakterierne giver mulighed for et effektivt streptavidin-valg, da det biotinylerede peptid nu vises på overfladen (figur 1a).

Formålet med denne metode er at udvælge nye varianter af BirA, som biotinylater peptidsekvenser til stede i indfødte proteiner. Systemet er kodet af gener, der findes på plasmid pBAD-BirA-eCPX-AP, som indeholder en Arabinose-inducerbar promotor, som kontrollerer BirA (araBAD), og en T7-promotor, som styrer eCPX⁹ (figur 1b). Denne protokol beskriver den detaljerede procedure for 1) inkorporering af et peptid afledt af et målprotein i C-terminalen af ecpx, 2) oprettelse af et Mutations Library of BirA med fejlbehæftet PCR, 3) udvælgelse af streptavidin-binding bakterier ved magnetisk-aktiveret celle sortering (MACS), 4) kvantificering af bakterie berigelse, og 5) indledende karakterisering af isolerede kloner.