Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

Caitlin  E. Beaver; Susan  R. Geda; Nathan  A. Johnson

doi:10.3791/60244

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biología

Стандартизация нелетального метода для характеристики репродуктивного статуса и ларвал развития пресноводных мидий (Bivalvia: Unionida)

Published: October 04, 2019

doi:

10.3791/60244

Caitlin E. Beaver¹, Susan R. Geda², Nathan A. Johnson¹

¹Wetland and Aquatic Research Center,United States Geological Survey, ²Garcon Point Aquatic Research Center,Florida Fish and Wildlife Conservation Commission

Summary

Сохранение пресноводных мидий зависит от мониторинга репродуктивных моделей и процессов видов. Это исследование стандартизирует нелетальный протокол для отбора проб по содержанию жабры, характеризует развитие личинок и обеспечивает цифровое хранилище для собранных данных. Этот пакет баз данных протокола будет важным инструментом для исследователей мидий в восстановлении находящихся под угрозой исчезновения видов.

Abstract

Активное наблюдение за сроками, развитием и репродуктивной моделью исчезающих видов имеет решающее значение при управлении восстановлением популяций. Пресноводные мидии являются одними из самых находящихся под угрозой организмов в мире, но информация о раннем развитии личинок (глочидиальный) и задумчивый периоды по-прежнему отсутствует для многих видов. Предыдущие исследования были сосредоточены на сложной стадии истории жизни, когда самки мидий готовы паразитировать на рыбу-хозяина, но лишь немногие исследования были сосредоточены на период задумчивости и сроки развития личинок. Описанный здесь протокол позволяет исследователям нелетально оценить состояние гравидности женских мидий. Результаты этого исследования показывают, что этот метод не влияет на способность женской мидии оставаться gravid или стать gravid снова после отбора проб была выполнена. Преимущество этого метода может позволить его использовать на федеральном угрожаемом или находящихся под угрозой исчезновения видов или других популяций, вызывающих высокую озабоченность сохранения. Этот протокол может быть адаптирован для использования как на сохраненных или живых особей и был протестирован на различных видах мидий. Предоставленная база данных является хранилищем для получения информации о сроках репродуктивных привычек и будет способствовать будущим исследованиям в области пресноводных мидий, сохранению и усилиям по восстановлению.

Introduction

Сохранение численности населения в пресноводных системах зависит от успеха воспроизводства и набора персонала. Для паразитических организмов выявление тонкостей жизненного цикла (например, этапов развития личинок и стратегий притяжения хозяев) может дать представление о репродуктивных привычках организма и критических процессах, влияющих на вербовку. Такая информация приобретает важное значение в тех случае, когда виды находятся под угрозой, и для поддержания оставшихся популяций необходима успешная вербовка или если восстановление требует использования эптэптирования для восстановления высыхаенных популяций.

Пресноводные мидии (Bivalvia: Unionida) считаются одной из самых находящихся под угрозой групп организмов во всем мире и компиляция видов конкретных репродуктивных привычек может помочь в исследованиях^{усилия 1}^,²^,³ ^,⁴^,⁵. С более чем 800 в настоящее время признанных видов, распределенных по всему миру, пресноводных мидий имеют горячие точки разнообразия в Северной и южной Америке, и в юго-восточной Азии, но основные истории жизни информация неизвестна для многих видов²^, ^5,^6,⁷. Семьи в рамках этого порядка характеризуются наличием паразитических личинок этапов, которые полные метаморфозы в свободноживущих несовершеннолетних во время привязанности к хозяину⁷^,⁸. Этот уникальный этап истории жизни способствует биоразнообразию в пресноводных системах, которые в настоящее время находятся в кризисе⁹. Высокий уровень опасности может быть отнесен ко многим антропогенным угрозам, включая загрязнение водных путей, изменение среды обитания и разрушение, сокращение численности и разнообразия рыб-хозяев, а также введение инвазивных видов¹^, ¹⁰. Как бентические фидеры фильтра, мидии норы в субстрат и восприимчивы к загрязняющим веществам и загрязняющих веществ, которые стекают в водораздел¹¹. Восстановление видов мидий является уместным, поскольку они обеспечивают широкий спектр экосистемных услуг, в том числе улавливания углерода, источник пищи, и очистка воды путем фильтрации кормления¹¹. Кроме того, мидии были найдены, чтобы указать здоровье экосистемы, способствовать биоразнообразию, и, в свою очередь, повышение устойчивости экосистемы¹².

Многие исследования пресноводных мидий были сосредоточены на изучении требований ранней истории жизни, чтобы лучше информировать оценки состояния видов и стратегии управления. Пресноводные семьи мидий, имеющие отношение к этому исследованию (например, Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) имеют уникальную стратегию истории жизни, где самки выводок личинки (глоцидия) в их сумчатых жабры⁸. Благодаря различным стратегиям, самка мидии изгоняет зрелые глочидии из сумчатых жабр, чтобы паразитировать позвоночных хозяина с глочидией¹³. Исследования по глочидиальной разработки в жабры был изменен с техникой использования подкожных шприцев для образца гонадной жидкости из живых мидий и оценить производство гамет¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. Как исследователи подтвердили эту нелетальную методологию для выборки гонад, она была адаптирована для сумчатых жаберных выборки для оценки выводка развития¹⁵^,¹⁶. Brood развития может быть использован для расшифровки филогенетических отношений, как некоторые виды мидий может выводок глочидии только в наружных двух жабры (эктобранч), только внутренние две жабры (эндобранч), или во всех четырех жабры (tetrabranchus), но эта характеристика не является известен для каждого вида¹⁷. Brooding моделей ранее были использованы для классификации видов мидий ли самки мидий выводок глочидия на зиму (брадитик) или в течение короткого периода летом (тахитик)¹⁸. Над зимовкой выводки мидий была поддержана, когда репродуктивный цикл Анодонта был изучен¹⁹. Тем не менее, основные репродуктивной биологии был изучен более тщательно на протяжении многих лет и обнаружили, что эта дихотомия была валового обобщения и задумчивый периоды некоторых видов являются гораздо более сложными, чем первоначально предполагалось²⁰^,²¹. Например, виды рода Hyridella (семья Hyriidae), Glebula, и Elliptio (семейный Unionidae) были замечены с свыше трех выводков за размножение^{сезон 22}^,²³^, ²⁴. Сложность видов конкретных, а иногда даже населения конкретных²⁰, репродуктивные привычки привели к разрыву в знаниях о сроках и продолжительности задумчивости, и количество выводков самка мидии может производить.

Хотя подкожные шприцы были использованы для извлечения содержимого жаберных, сообщение о результатах осложняется из-за отсутствия стандартизации для обеспечения сопоставимых результатов во всех исследованиях. Ранее четыре стадии развития глочидии (т.е. яйцеклетки, эмбриона, незрелые, полностью развитые) были выявлены в Unionidae, но не были приняты в стандартную процедуру¹⁶^,²⁵^,²⁶. Другие исследования наблюдения членов Margaritiferidae заменили классификацию “незрелых глочидия” с “развивающихся глочидия”, что приводит к потенциальной путаницы²⁷^,²⁸. Отсутствие последовательности в характеристике различных этапов развития личинок оставил многие исследователи, как правило, описывают задумчивые женщины, как “gravid”, который не охватывает тонкости развития личинок. Исследования истории жизни проведения принимающей рыбы испытаний приоритеты необходимость gravid женщин с полностью развитой глочидии, но эта информация разбросана по всей опубликованной и неопубликованной литературы²⁹^,³⁰. В настоящее время отсутствуют данные о репродуктивных привычках многих видов мидий, включая сроки перехода между яйцом, незрелой глочидией и полностью развитой глочидией, готовой к прикреплению к хозяевам. Для большинства видов неясно, как долго самки размышляют глочидия и как быстро оплодотворенные яйцеклетки полностью развиваются. Пробелы в знаниях часто шире для видов сохранения озабоченность, которая представляет необходимость стандартизированного метода извлечения содержимого жабры, который был протестирован на нелетальные эффекты и может быть повышен до научного сообщества в дополнение к научному сообществу в дополнение основные методологии сбора данных, не представляющие угрозы для защищенных групп населения^24,^31,³².

Это исследование имело три цели: 1) формализовать метод отбора жабры и проверить его на летальные и нелетальные воздействия на женские мидии на месте, 2) характеризуют различные этапы развития глочидиального и описывают стандартизированный метод идентификации и отчетности различных этапов личинок, и 3) создать общедоступное хранилище для собранных данных. Полевые обследования, долгосрочные проекты мониторинга и музейные коллекции — все это открывает возможности для осуществления протокола, описанного здесь, и сбора дополнительных данных для более широкого круга интересов. Формализованный протокол включает визуальные эффекты и описания символов для дифференциирования каждого этапа развития личинок. Стандартизируя категории, собранные результаты можно сравнить между всеми случаями и видами. После сбора данных все они могут быть отправлены в альманах Freshwater Mussel Gravidity (FMGA), который представляет собой базу данных для информации о гравитации, собранной с помощью этого протокола. Окончательный продукт для хранения и компиляции всей собранной информации gravidity обеспечит исследовательский инструмент для облегчения будущих исследований, сохранения и восстановления усилий. Включение этой методологии в различные проекты мидий и представление данных в ФМГА расширит масштабы знаний о статусе видов мидий в течение всего года. Этот протокол и полученная в результате база данных о репродуктивных привычках пресноводных мидий, как группа, находящихся под угрозой исчезновения, имеет важное значение для понимания динамики популяций и содействия сохранению этих видов.

Protocol

1. Gravid женская коллекция ПРИМЕЧАНИЕ: Ссылка На Протокол обследования пресноводных мидов Службы рыбы и дикой природы33 для получения рекомендаций о том, как надлежащим образом обследовать место отбора проб на угрожаемые или исчезающие виды. Надлежащие федеральные разрешения должны быть получены до сбора на местах охраняемых видов и государственных разрешений для всех видов, присутствующих. Собирайте живые мидии с поля с помощью тактильных визуальных методов (шаг 1.2) или используйте сохранившиеся экземпляры из музея (шаг 1.3).ПРИМЕЧАНИЕ: Важно держать живые мидии прохладной и влажной после сбора, чтобы предотвратить высыхание и уменьшить стресс, и минимальная обработка gravid мидий важно, чтобы избежать женщин преждевременно выпускать содержание жабры34. Оценить женскую гравитацию либо путем визуального осмотра во время сбора (например, наличие мантии приманки, конглутинатов и т.д.), либо путем визуального осмотра после сбора (например, мягко подглядывающих открытых клапанов достаточно, чтобы заглянуть внутрь и посмотреть, завышены ли жабры, см. Рисунок 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Виды различаются в том, как глочидия задумчивый в сумчатых жабры, как иногда только два внешних жабры (эктобранч), только два внутренних жабры (эндобранч), или все четыре жабры (тетрагенные) являются сумчатые17. Протокол можно приложить здесь, и gravid женщины могут быть транспортированы обратно в лабораторию для взятия проб жабры. Рисунок 1: Аккуратно посторонних людей открытыми. Чтобы проверить gravidity живой мидии, осторожно подглядывать открыть клапаны с большими пальцами(A) или осторожно использовать speculum или обратный плоскогубцы, чтобы подглядывать открыть клапаны (B). Просмотрите шаг 2.3 в протоколе для предостережений, связанных с этим методом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Выполните визуальный осмотр на сохранившихся образцах, открыв клапаны и осматривая жабры, чтобы определить, является ли человек gravid самка(рисунок 2). Рисунок 2: Как определить gravid женщины. Самки сумчатых жабры мидии появляются надутые, когда самка гравидирует и задумчивается. Фотографии A и C показывают жабры с боковой точки зрения, в то время как фотографии B и D обеспечивают брюшной вид жабры. Красные ящики наметить жабры, чтобы подчеркнуть различия между gravid (A / B) и не gravid (C / D) женский Lampsilis straminea мидии. Общая длина особей составляет 79 мм (A/B) и 88 мм (C/D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 2. Выборка содержания погиль ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть адаптирован ли отбор проб происходит на живых мидий в поле и лаборатории, или на сохранившихся образцов. Подготовьте 1,5 мл пластиковой микроцентрифугной трубки для сбора с примерно 1 мл стерильной воды, если содержимое жабры будет оценено в пределах 24 ч от извлечения35 или этанола (EtOH), если оценка выборки не может произойти в пределах 24 ч сбора или если жабра содержимое из музея образца, сохранившегося в EtOH. Если глочидия предназначена для сканирования электронного микроскопа (SEM) изображения, используйте 70% EtOH, и если глоцидия будет использоваться для генетического тестирования, используйте неденатурированный 95% EtOH36. Удалите бумажную упаковку для одной стерильной иглы 20 G bevel-tip на шприц 10 мл. Отвиньте крышку, чтобы разоблачить иглу и подготовить 1,5 мл пластиковой трубки для сбора жаберного содержания. Нажмите на ручку шприца весь путь вниз, чтобы черная пробка находится на линии 0 мл/куб. м.ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильный шприц следует использовать каждый раз, когда содержимое жабры отбирают. Использованный шприц можно стерилизовать в поле путем окунать кончик в раствор 10% отбеливателя, после этого промыть шприц путем заполнять его с 1 mL стерильной воды и угнетать поршень назад до 0 mL/cc, и окончательно сушить шприц с чистой тканью. Возьмите gravid женщины и осторожно подглядывать открыть два клапана, используя кончики больших пальцев.ПРЕДЕПЛИЯ: Будьте осторожны, чтобы не навредить животному. Открытие клапанов слишком широко или слишком быстро может перенапрягать мышцы аддуктора и вызвать смертность. Особенно уязвимы на этом этапе тонкооболочки (например, виды анодонта, лептодеа, Аттербэкияи т.д.) и молодые особи. Насильственное обращение с хрупкими оболочками видов может взломать оболочки и привести к гибели людей. В некоторых случаях, выдавливание тонкой оболочки животных из передней и задней оболочки края, глядя на брюшной поверхности, приведет к оболочке сгибать и зиять немного, что позволяет наблюдать жабры или подглядывать открыть оболочки и избежать повреждения хрупкой оболочки маржи.ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты могут быть использованы для оказания помощи в этом шаге, но также может привести к смертности, если не используется с осторожностью и следует избегать, когда это возможно. Например, speculum или измененный комплект обратных плоскогубцев могут быть использованы для того чтобы помочь pry индивидуал открытое и клин можно использовать для того чтобы помочь опора клапанов раскрыть. Эти инструменты могут быть не нужны, если другой человек доступен для оказания помощи (т.е. один человек держит животное открытым, а другой маневрирует шприц для извлечения). Повреждение или отделение ткани мантии от периостракума может привести к деформациям роста и смертности37; поэтому крайне важно не разрывать связь между мантийной тканью и внешней окраиной оболочки. Используйте кончик шприца, чтобы аккуратно проникнуть в одну водяную трубку надутого сумчатого жабры. Далее, осторожно совок жаберного содержимого, используя смоченной кончик иглы.ПРИМЕЧАНИЕ: Содержимое джилл обычно имеет молочно-белую консистенцию, которая должна быть видна на слеженной кончике иглы. Депозит содержимое шприца непосредственно в чашку Петри, если микроскоп легко доступен. В противном случае храните содержимое в пластиковой микроцентрифуговой трубке мощностью 1,5 мл с выделенной жидкостью (см. шаг 2.1) для последующей оценки.ПРИМЕЧАНИЕ: Свести к минимуму нарушения и обработки образцов глочидии во время транспортировки, чтобы избежать повреждения и снижения жизнеспособности32,35. Запись информации об идентификации рода-видов, статусе gravidity, длине самки (мм), коллекторе и контактной информации, состоянии, округе, дренаже, конкретном местесбора, широте и долготе, уникальном идентификаторе для жабра образец, уникальный идентификатор для сайта обследования, и дата сбора, если содержимое жабры были извлечены(рисунок 3). Запись уникального идентификатора на каждом сборе судов для обеспечения точной записи данных во время транспортировки. Фотография внешнего правого клапана мидии для проверки личности и включить трубку помечены уникальным идентификатором разборчивы на картинке. Дополнительно, собирать другие абиотические и биотические параметры в дополнение к информации об окружающей среде и сообщества мидии был найден в (см. рисунок 3 для предложений). Рисунок 3: Пример таблицы данных о гравитации поля. Для получения достоверной информации необходима точная отчетность данных. Это пример таблицы данных на местах с минимальными полями и дополнительными абиотическими параметрами, которые должны быть собраны вместе с каждым образцом жабры. Для получения более подробной информации, пожалуйста, смотрите шаг 4.1 в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 3. Лабораторная оценка содержания жабры Если содержимое жабры в трубке 1,5 мл, перенесите их в чашку Петри и заполните дно блюда водой. Аккуратно закружить чашку Петри круговыми движениями, чтобы собрать содержимое в центре блюда для более концентрированного вида образца.ПРИМЕЧАНИЕ: 1,5 мл трубки, возможно, должны быть промыты с помощью шприц бутылку или передачи трубки заполнены водой, если жебернского содержимого прилипания к трубкам трубки. Поместите чашку Петри под рассекающий микроскоп для оценки образца. Если возможно, сфотографируйте образец жабры под микроскопом и пометьте его уникальным идентификатором для этого образца. Запись результатов, какие стадии развития присутствуют в каждом образце жабры. Используйте рисунок 4 в качестве руководства для характеристики каждого этапа развития. В некоторых случаях самки могут быть задумчивыми личинками на нескольких стадиях развития; поэтому сообщить о каждом этапе развития, наблюдаемом в данной выборке (например, ‘EGG/DG/IMG/FDG’). После того, как сохранены глочидия были оценены, перейти к разделу 4. Если полностью развитая глочидия выявлена и EtOH не использовался для сохранения, приступайте к шагу 3.3.ПРИМЕЧАНИЕ: EGG, яичные массы; ГД, развивающая глочидию; IMG, незрелый глочидия; FDG, полностью развитая глочидия. Рисунок 4: Представления для различных стадий развития глочидии в сумчатых жабры. (A) Яичные массы (EGG) имеют мембрану, которая делает яйца слипаются вместе. В каждой яичной мембране существует непрозрачная сферическая масса дифференарных клеток. Непрозрачная сферическая масса может разделиться на несколько сферических масс во время раннего деления клеток, но все равно должна быть записана как EGG до тех пор, пока не будет замечена различная форма. (B) Незрелые глочидия (IMG) имеют различные двустворчатые формы массы, содержащиеся в яичной мембране. (C) Разработка глочидии (DG) имеют различные двустворчатой формы, без яичной мембраны, и неорганизованной ткани внутри, часто нечеткой по внешнему виду. Разработка глочидии (DG) не реактивна при воздействии NaCl и классифицируется как “DG (T)” при записи данных. (D) Полностью развитая глочидия (FDG) имеют различные двустворчатой формы и очевидной адуктор мышечной ткани позволяет глочидии, чтобы закрыть. Полностью развитый глочидиа (FDG) часто наблюдаются как два открытых клапана после консервации. Два открытых клапана, как правило, оснастки закрыты, или оснастки открытыми и закрытыми, при воздействии NaCl и классифицируются как “FDG (T)”. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Проведите тест хлорида натрия (NaCl) для дальнейшей оценки жизнеспособности любого полностью развитого глочидии, добавив кристалл NaCl в подмножество капли жаберной пробы35. Жизнеспособная глочидия будет реагировать на NaCl, закрывая свои клапаны из открытого положения. Сообщите о любых проверенных сольми глочидия с ‘(T)’ в конце обозначения при записи данных.ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью развитая глочидия также может наблюдаться активно щелкающий открытым и закрытым без воздействия NaCl. 4. Отчет в базу данных Доступ к FMGA веб (http://arcg.is/089uee), который был разработан с помощью онлайн-программ38,39,40. Страница FMGA содержит ссылку на форму ввода данных на рабочем столе и загрузку приложения для мобильных устройств. Мобильное приложение позволяет вводом данных в поле и автоматизированной геоссылке41.ПРИМЕЧАНИЕ: Календарь gravidity и другие графики, связанные с пресноводных видов истории жизни события также можно найти на FMGA панели. Используйте мобильное приложение или настольный сайт для записи результатов в форме ввода данных, используя выпадающие меню и поля для ввода текста. Для больших, уже существующих наборов данных, свяжитесь с авторами для таблицы шаблона. Введите записанные данные под соответствующими заголовками столбца, имея в виду, что каждая запись или строка в таблице представляет собой наблюдения образца жаберных дал от одного человека gravid. Отправить результаты, и они будут добавлены в базу данных FMGA после проверки администратором, который может связаться с коллекционером, чтобы запросить дополнительную информацию или фотографии.ПРИМЕЧАНИЕ: После проверки и компиляции данных в базе данных FMGA будут обновлены все календари gravidity и другая интерактивная графика, отображаемые на панели мониторинга FMGA.

Representative Results

Этот протокол был применен в ходе исследования захвата-марки,который отслеживал сообщество пресноводных мидий впределах участка Брюс-Крик (округ Уолтон, Флорида) с января 2015 года по декабрь 2015 года. Отбор полевых проб планировалось проводить каждые четыре недели; однако из-за событий высокого потока отбор проб не проводился в апреле или сентябре 2015 года. Государственные и федеральные учреждения, включая Геологическую службу США, Службу охраны рыбных ресурсов и дикой природы США и Комиссию по охране рыбных ресурсов и дикой природы Флориды, оказали помощь в проведении полевых обследований и взятии проб жабры. Каждая гравидная самка, с которой они столкнулись в ходе обследования, подвергалась выборке содержания в поле с использованием описанного выше протокола, помечена (см. Таблица материалов),и помещена обратно в речной субстрат. Образцы жабры хранились в 95% EtOH и транспортировались в лабораторию Центра водно-болотных угодий Геологической службы США для оценки содержания жабры. Пометив самок и отвоевав их через ежемесячные интервалы в течение года, мы оценили как смертоносное, так и нелетёное воздействие протокола о пробах жабры на 90 особей. Следующие семь видов были отбиты в ходе этого исследования: Elliptio pullata (n No 5), Fusconaia burkei (n no 1), Hamiota australis (n No 19), Obovaria choctawensis (n no 1), Strophitus williamsi (n q 1), Villosa lienosa (n No 60) и Villosa vibex (n No 3). Наша выборка включала особей общей длины от 24 мм до 80 мм и два вида(F. burkei и H. australis),охраняемых Законом США об исчезающих видах. Все данные, используемые в этом исследовании, являются общедоступными Мы предоставили доступ к нашему набору данных на ScienceBase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)42. Выживание было оценено по тому, сколько людей были отбиты живыми после сбора жаберных образцов. Мы наблюдали высокий уровень выживаемости (97%) во время исследования с некоторой смертностью, возможно, пригодной для хищничества, о чем свидетельствуют наблюдения на месте. Результаты показали, около 51% лиц (46 из 90) были найдены, чтобы остаться gravid между последовательными событиями отбора проб. Еще 10% особей (9 из 90) были найдены gravid, отбиты не gravid, и нашли gravid снова. Около 39% людей (35 из 90) в этом исследовании были найдены gravid, жаберный образец был взят, но когда вновь поймали в течение года, они никогда не были найдены gravid во второй раз. Результаты показывают, что описанный здесь протокол не является ни смертельным, ни сублетальным и существенно не нарушает текущий период задумчивого периода после взятия жабры. Хотя размеры выборки в этом исследовании неравны между видами, результаты этого исследования подчеркивают полезное и практическое применение этого протокола. Календарь gravidity для V. lienosa иллюстрирует gravid самок задумчивый FDG были найдены почти каждый месяц года, кроме августа, когда только женщины задумчивый EGG были найдены(Рисунок 5A). Самки H. australis были найдены не gravid (NG) в июле, августе и декабре. Большая доля женщин были задумчивый FDG в январе и феврале, но были также найдены в октябре и ноябре(рисунок 5B). Никакие индивидуалы E. pullata не были найдены задумчивый FDG хотя женщины были задумчивый EGG от мая до джун, и одна gravid женщина записанная (GFR) в Джун(рисунок 5C). Единственная гравидная самка F. burkei была найдена GFR в июне и отбита НГ в июле. Тот же O. choctawensis человек был собран FDG в феврале и вновь NG в июле. Только один С. Уильямси был найден и трижды был отбит. Эта женщина была найдена FDG в марте, NG в мае, GFR в июне, и EGG вавгусте (рисунок 5C). Gravid женщин V. vibex задумчивый FDG были найдены в период с февраля по июнь(рисунок 5C). Рисунок 5: Результаты исследования в Брюс-Крик, штат Флорида отображается в формате gravidity календаря. (A) Gravidity календарь для Villosa lienosa захватывает / захватывает. (B) Gravidity календарь для Hamiota australis захватывает / захватывает. (C) Gravidity календари для всех видов с менее чем 10 лиц, отобранных. Оси y включает в себя аббревиатуры за месяцы января (Ja), Февраль (F), Март (г-н), май (Мой), Июнь (Jn), Июль (Jl) Август (A), Октябрь (O), Ноябрь (N) и декабрь (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Значение

Сохранение находящихся под угрозой исчезновения видов зависит от успешного набора в пределах существующих популяций. В некоторых случаях может потребоваться искусственное распространение для расширения набора этих групп риска. Это требует, чтобы исследователи были проинформированы о сроках активного размножения для каждого вида и, возможно, применяли различные методологии или методы управления для смягчения последствий для набора персонала. Как находящихся под угрозой группы организмов, крайне важно установить стандартизированный и нелетальный подход к изучению репродуктивных привычек, а также обеспечить платформу для компиляции и визуализации данных для информирования научного сообщества с самыми современными информации. Это исследование обеспечивает пошаговый протокол для обеспечения мер предосторожности, и содержимое жабры может быть надлежащим образом отобраны и оценены из женских мидий. Этот протокол был протестирован на наличие летальных и нелетальных эффектов, что позволило исследователям и руководителям ответственно внедрить эту методологию. Мы также разработали набор инструментов и приложений для управления базами данных для облегчения компиляции информации о гравидности на общедоступной, удобной панели мониторинга. Исследования по эпидемиологии, морфологии глоцидии, истории жизни, филогенетике, распространению и транслокациям могут принести пользу и использовать это хранилище информации о временной гравитации для всех видов пресноводных мидий.

Это исследование только поддержало предыдущие исследования выводы некоторых видов репродуктивных привычек, но и показали новую информацию о других. Хотя V. vibex был собран в меньшем количестве, чем V. lienosa, сходство можно найти между ними на основе данных gravidity. Оба вида Villosa, кажется, выводок полностью развитой глочидии в течение большей части года, который характеризует их как перезимующий brooder. Это согласуется с предыдущими исследованиями на других видах Villosa ⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵. Результаты этого исследования показывают, H. australis можно найти gravid с октября и перезимовающихся в июне, за исключением не захватывает были найдены gravid в декабре. Ранее опубликованное исследование определило конгенер H. altilis с периодом gravidity 4 месяцев, март омсужение⁴⁶^,⁴⁷. Этот вывод иллюстрирует более длительный период gravidity, чем считалось ранее, и, как правило, группы H. australis как перезимующий бройдер. Как охраняемые на федеральном уровне виды, различные периоды задумчивости для H. altilis и H. australis могут повлиять на управленческие решения, чтобы лучше защитить население в репродуктивно активное время. Elliptio pullata были найдены только gravid с EGG в мае и июне, что соответствует их характеристике как тахитические виды с очень коротким периодом задумчивости²⁴^,⁴⁸^,⁴⁹^, ⁵⁰. По мере того как данные собираются на видах Elliptio используя этот протокол, детальная информация может сделать усилия поля более эффективными когда некоторые этапы развития glochidial пристрелны, в виду того что glochidia только найдено немного месяцев из года. Выводы других видов с более низкими размерами выборки ограничены, но по мере того, как данные вносятся в базу данных, более высокие размеры выборки дадут представление о репродуктивных привычках других видов мидий.

Процедурные комментарии

Пресноводные мидии и их глочидия, как известно, восприимчивы к антропогенным стрессоров¹⁰^,³⁵. Во время осмотра gravidity, клапаны мидии не могут быть легки для того чтобы раскрыть, и небрежно принуждать клапаны раскрыть может причинить непреднамеренный вред и привести к в усилии или смертности. Некоторые хрупкие оболочки видов (например, виды Анодонта, Leptodea, Utterbackiaи т.д.) и меньшего размера лиц могут иметь очень хрупкие оболочки и слабые мышцы аддуктора, которые могут сломать и разорвать легко. Выборка из джилл может рассматриваться как стрессор, если обработка не осуществляется ответственно и с осторожностью. Предыдущее исследование показало, что обработка и воздушное воздействие мидий во время репродуктивно активного времени может вызвать различные физиологические стрессы, в том числе преждевременное высвобождение содержания жабры³⁴. Тем не менее, исследование с использованием аналогичной методологии, как описано здесь, обнаружили обработки gravid женских мидий во время взятия жабры не прерывать настоящий выводок или вызвать преждевременное освобождение в краткосрочной и долгосрочной задумчивый видов¹⁶. Кроме того, стерильный шприц должен быть использован во время этого протокола для предотвращения любых непреднамеренных инфекций или перекрестного загрязнения при проколе жабры нескольких людей. Кроме того, глочидия являются хрупкими и выводки могут быть созрели и подчеркнул, но не исключены. Зрелые глочидии в плохом здоровье может привести к меньшему количеству людей, реагирующих на тесты соли^35. При проведении различия между ГД (Т) и FDG (T) важно, чтобы соль тест с большим размером выборки, делать заметки о наблюдениях, чтобы тщательно определить различия между ГД и FDG glochidia с использованием описаний, представленных в этом исследовании. При надлежащем уходе, минимальный стресс, вызванный этой процедурой, может позволить самкам мидий продолжать задумчивый глочидия естественным путем и уменьшить воздействие на набор персонала среди населения.

Дополнительные данные могут быть записаны в дополнение к базе данных и обеспечивают широкий контекст для репродуктивных привычек пресноводных мидий. Некоторые виды (например, виды Fusconaia), были замечены жабры различных цветов на основе стадии развития глочидии⁵¹. Во время первоначальной проверки gravidity женщины, описание цвета жабера может быть включено в сообщенные данные для того чтобы позволить для будущего исследования. Кроме того, на данный момент в протоколе, исследователи могут отметить, является ли задумчивый самка была найдена задумчивый глочидия в двух внешних жабры (эктобранчус), два внутренних жабры (эндоотрасль), или все четыре жабры (тетрагенные)¹⁷. Эта информация может быть добавлена в FMGA и помочь заполнить пробелы в данных относительно задумчивости для каждого исследуемого вида. Экологические условия, в частности температура воды, могут быть собраны и зарегистрированы в полевых условиях для более полного наблюдения за состоянием и сроками заболевания видов на различных радиусах латитудинального диапазона. Исследования показывают, что экологические параметры, такие как температура, фотопериод, скорость потока и наличие продуктов питания, могут вызывать репродуктивные явления в пресноводных мидиях^52,^53,^54,⁵⁵ ^,⁵⁶. Дополнительные поля могут быть добавлены в базу данных, поскольку они представлены для содействия будущим исследованиям абиотических факторов, влияющих на гравитацию. В этот протокол также может быть добавлена модификация захвата-марки-захвата, смоделированная по образцу нашего исследования, которая позволит исследователям отслеживать репродуктивные привычки конкретного мидии и раскрывать информацию о множественном выводке в год.

Точность информации в FMGA зависит от источника. Например, неправильное определение пресноводных мидий является общим из-за многих видов, имеющих аналогичные внешние характеристики, которые делают его трудно провести различие между видами⁵⁷. Образец жаберных кабр, взятый у неверно идентифицированного человека, может создать путаницу и ложную информацию для периода задумчивого вида. Если берется проба жаберных, фотографии должны быть сделаны внутри обоих клапанов (если человек не жив), за пределами правого клапана, и umbo (шар, где два клапана подключиться) и представлены с gravidity данных через настольный сайт или мобильное приложение. Мы также приветствуем фотографии содержания жабры. В формах представления есть выпадающее меню, позволяющее коллекционеру указать свой уровень доверия к идентификации видов. До проверки записи эта информация будет учитываться при проверке идентификации коллектора на наличие правдоподобного распространения и т.д. Из-за высокой степени внутриспецифических морфологических изменений в видах Unionidae, представление образцов ткани поощряется и может быть необходимо для облегчения молекулярной идентификации.

Будущие последствия

В качестве нелетального метода этот протокол может применяться как к обычным, так и к находящимся под угрозой исчезновения видам. Календари gravidity для находящихся под угрозой исчезновения видов могут помочь менеджерам по сохранению, связанным с законодательством об исчезающих видах и планированием восстановления, предоставляя информацию о временных периодах, когда виды являются репродуктивными. Государственные и федеральные учреждения, которые управляют видами, подвергающимися риску, могут лучше консультировать разрешить выделение разрешений на время, когда вид не уязвим и размножается, и даже ограничить урожай рыбы-хозяина во время задумчивости полностью развитой глочидии. Кроме того, полевые обследования могут быть ориентированы на виды в нерепродуктивные периоды, с тем чтобы свести к минимуму воздействие на процессы найма. Общедоступная база данных, FMGA, предоставляет исследователям и руководителям инструмент для получения важной репродуктивной информации о любых целевых видах пресноводных мидий. База данных будет также выделять пробелы в данных, поощряя дальнейшие исследования в области моделей задумчивости в конкретных видах. Поскольку понимание репродуктивной модели видов позволяет осуществлять адекватные управленческие решения, мы надеемся, что наш протокол и база данных облегчат будущие исследования, сохранение и восстановление пресноводных мидий.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить источники финансирования: Служба охраны рыбных ресурсов и дикой природы США и Геологическая служба США. Особая благодарность Эндрю Hartzog и Сандра Pursifull для организации полевых экипажей и сбора данных, а также Лорен Паттерсон и Крис Андерсон за их ценный вклад в разработку базы данных. Мы также хотели бы поблагодарить всех, кто помогал в этой области и лаборатории, включая Шерри Bostick, Марк Кантрелл, Sahale Casebolt, Джордан Холкомб, Говард Джелкс, Гэри Махон, Джон Маклеод, Кайл Мун, Кайла Морнингстар, Эмма Пистоле, Мэтт Роу, Ченнинг Санкт Обин и Джим Уильямс. Любое использование торговых, фирменных или товарных наименований предназначено только для описательных целей и не подразумевает одобрения со стороны правительства США.

Materials

1.5 mL snap cap centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510	Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost.
20 G needle on 10 mL disposable syringe	Exelint International	26255	sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2"
Dissecting Microscope	any	any
Marking Pen	Fisher Scientific	13-379-4	This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof.
Molecular grade ethanol	any	any	Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work.
Paper	any	any	Needed to record information on samples collected.
Pen/pencil	any	any	If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine.
Petri dish	DWK Life Sciences (Kimble)	23000-9050	This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used.
Sodium Chloride	any	any	Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this.
Speculum	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.
Sterile water	any	any	Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection.
Super glue	Gorilla	Gorilla super glue gel	Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Tags	Hallprint	FPN 8×4	Only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Transfer Pipet	Thermo Scientific Samco	225	This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable.
Tweezers	any	any	Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this.
Waterproof paper	RainWriter	any	Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from.
Wooden pick	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.

Referencias

Williams, J. D., Warren, M. L., Cummings, K. S., Harris, J. L., Neves, R. J. Conservation status of freshwater mussels of the United States and Canada. Fisheries. 18 (9), 6-22 (1993).
Lopes-Lima, M., et al. Conservation status of freshwater mussels in Europe: state of the art and future challenges. Biological Reviews. 92 (1), 572-607 (2017).
Zieritz, A., et al. Diversity, biogeography and conservation of freshwater mussels (Bivalvia: Unionida) in East and Southeast Asia. Hydrobiologia. 810 (1), 29-44 (2018).
Haag, W. R., Williams, J. D. Biodiversity on the brink: an assessment of conservation strategies for North American freshwater mussels. Hydrobiologia. 735 (1), 45-60 (2014).
Ferreira-Rodríguez, N., et al. Research priorities for freshwater mussel conservation assessment. Biological Conservation. 231, 77-87 (2019).
Graf, D. L., Cummings, K. S. Review of the systematics and global diversity of freshwater mussel species (Bivalvia: Unionoida). Journal of Molluscan Studies. 73 (4), 291-314 (2007).
Lydeard, C., Cummings, K. . Freshwater mollusks of the world: a distribution atlas. , (2019).
Wächtler, K., Dreher-Mansur, M. C., Richter, T., Bauer, G., Wächtler, K. Larval types and early postlarval biology in naiads (Unionoida). Ecology and evolution of the freshwater mussels Unionoida. , 93-125 (2001).
Dudgeon, D., et al. Freshwater biodiversity: importance, threats, status and conservation challenges. Biological Reviews. 81 (2), 163-182 (2006).
Downing, J. A., Van Meter, P., Woolnough, D. A. Suspects and evidence: a review of the causes of extirpation and decline in freshwater mussels. Animal biodiversity and Conservation. 33 (2), 151-185 (2010).
Vaughn, C. C. Ecosystem services provided by freshwater mussels. Hydrobiologia. 810 (1), 15-27 (2018).
Aldridge, D. C., Fayle, T. M., Jackson, N. Freshwater mussel abundance predicts biodiversity in UK lowland rivers. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 17 (6), 554-564 (2007).
Barnhart, M. C., Haag, W. R., Roston, W. N. Adaptations to host infection and larval parasitism in Unionoida. Journal of the North American Benthological Society. 27 (2), 370-394 (2008).
Saha, S., Layzer, J. B. Evaluation of a nonlethal technique for determining sex of freshwater mussels. Journal of the North American Benthological Society. 27 (1), 84-89 (2008).
Tsakiris, E. T., Randklev, C. R., Conway, K. W. Effectiveness of a nonlethal method to quantify gamete production in freshwater mussels. Freshwater Science. 35 (3), 958-973 (2016).
Gascho, L., Andrew, M., Stoeckel, J. A. Multi-stage disruption of freshwater mussel reproduction by high suspended solids in short-and long-term brooders. Freshwater Biology. 61 (2), 229-238 (2016).
Bauer, G., Wächtler, K. . Ecology and evolution of the freshwater mussels Unionoida. , (2012).
Ortmann, A. E. Notes upon the families and genera of the najades. Annals of the Carnegie Museum. 8 (2), 222 (1912).
Heard, W. H. Sexuality and other aspects of reproduction in Anodonta (Pelecypoda: Unionidae). Malacologia. 15, 81-103 (1975).
Heard, W. H. Brooding patterns in freshwater mussels. Malacological Review. 7, 105-121 (1998).
Watters, G. T., O’Dee, S. H. Glochidial release as a function of water temperature: beyond bradyticty and tachyticty. Proceedings of the Conservation, Captive Care, and Propagation of Freshwater Mussels Symposium. , 135-140 (1998).
Parker, R. S., Hackney, C. T., Vidrine, M. F. Ecology and Reproductive Strategy of a South Louisiana Freshwater Mussel, Glebula Rotundata (Lamarck) (Unionidae: Lampsilini). Freshwater Invertebrate Biology. 3 (2), 53-58 (1984).
Jones, H. A., Simpson, R. D., Humphrey, C. L. The reproductive cycles and glochidia of fresh-water mussels (Bivalvia: Hyriidae) of the Macleay River, Northern New South Wales, Australia. Malacologia. 27 (1), 185-202 (1986).
Price, J. E., Eads, C. B. Brooding patterns in three freshwater mussels of the genus Elliptio in the Broad River in South Carolina. American Malacological Bulletin. 29 (1), 121-126 (2011).
Haag, W. R., Staton, J. L. Variation in fecundity and other reproductive traits in freshwater mussels. Freshwater Biology. 48 (12), 2118-2130 (2003).
Soler, J., Wantzen, K. M., Jugé, P., Araujo, R. Brooding and glochidia release in Margaritifera auricularia (Spengler, 1793) (Unionoida: Margaritiferidae). Journal of Molluscan Studies. 84 (2), 182-189 (2018).
Smith, D. G. Notes on the biology of Margaritifera margaritifera margaritifera (Lin.) in Central Massachusetts. American Midland Naturalist. , 252-256 (1976).
O’Brien, C., Nez, D., Wolf, D., Box, J. B. Reproductive biology of Anodonta californiensis, Gonidea angulata, and Margaritifera falcata (Bivalvia: Unionoida) in the Middle Fork John Day River, Oregon. Northwest Science. 87 (1), 59-73 (2013).
Haag, W. R., Warren, M. L. Host fishes and reproductive biology of 6 freshwater mussel species from the Mobile Basin, USA. Journal of the North American Benthological Society. 16 (3), 576-585 (1997).
O’Dee, S. H., Watters, G. T. New or confirmed host identifications for ten freshwater mussels. Proceedings of the Conservation, Captive Care, and Propagation of Freshwater Mussels Symposium. , 77-82 (1998).
Johnson, N. A., McLeod, J. M., Holcomb, J., Rowe, M., Williams, J. D. Early life history and spatiotemporal changes in distribution of the rediscovered Suwannee moccasinshell Medionidus walkeri (Bivalvia: Unionidae). Endangered Species Research. 31, 163-175 (2016).
McLeod, J. M., Jelks, H. L., Pursifull, S., Johnson, N. A. Characterizing the early life history of an imperiled freshwater mussel (Ptychobranchus jonesi) with host-fish determination and fecundity estimation. Freshwater Science. 36 (2), 338-350 (2017).
Carlson, S., Lawrence, A., Blalock-Herod, H., McCafferty, K., Abbott, S. Freshwater mussel survey protocol for the Southeastern Atlantic Slope and Northeastern Gulf drainages in Florida and Georgia. US Fish and Wildlife Service, Ecological Services and Fisheries Resources Offices and Georgia Department of Transportation, Office of Environment and Location. , (2008).
Waller, D. L., Rach, J. J., Cope, G. W., Miller, G. A. Effects of handling and aerial exposure on the survival of unionid mussels. Journal of Freshwater Ecology. 10 (3), 199-207 (1995).
Fritts, A. K., et al. Assessment of toxicity test endpoints for freshwater mussel larvae (glochidia). Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (1), 199-207 (2014).
Christian, A. D., Monroe, E. M., Asher, A. M., Loutsch, J. M., Berg, D. J. Methods of DNA extraction and PCR amplification for individual freshwater mussel (Bivalvia: Unionidae) glochidia, with the first report of multiple paternity in these organisms. Molecular Ecology Notes. 7 (4), 570-573 (2007).
Henley, W. F., Grobler, P. J., Neves, R. J. Non-invasive method to obtain DNA from freshwater mussels (Bivalvia: Unionidae). Journal of Shellfish Research. 25 (3), 975-978 (2006).
ESRI. ArcGIS Desktop 10.6.1.9270. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2017).
ESRI. ArcGIS Online. ESRI Geospatial Cloud: Survey123 Field Application for ArcGIS 3.3.64. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2019).
ESRI. ArcGIS Online. ESRI Geospatial Cloud: Survey123 Connect for ArcGIS 3.3.51. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2019).
ESRI. ArcGIS Online. ESRI Geospatial Cloud: Operations Dashboard for ArcGIS. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2019).
Johnson, N. A., Beaver, C. E. Empirical data supporting a non-lethal method for characterizing the reproductive status and larval development of freshwater mussels (Bivalvia: Unionida). U.S. Geological Survey data release. , (2019).
Ortmann, A. E. A monograph of the naides of Pennsylvania. Memoirs of the Carnegie Museum. 8, (1919).
Posey, W. R. Life History and Population Biology of the State Special Concern Ouachita Creekshell, Villosa arkansasensis (I. Lea 1862). Arkansas Game and Fish Commission. , (2007).
Asher, A. M., Christian, A. D. Population characteristics of the mussel Villosa iris (Lea) (rainbow shell) in the Spring River watershed, Arkansas. Southeastern Naturalist. 11 (2), 219-239 (2012).
Haag, W. R., Warren, M. L., Shillingsford, M. Host fishes and host-attracting behavior of Lampsilis altilis and Villosa vibex (Bivalvia: Unionidae). The American Midland Naturalist. 141 (1), 149-158 (1999).
Roe, K. J., Hartfield, P. D. Ham,iota a new genus of freshwater mussel (Bivalvia: Unionidae) from the Gulf of Mexico drainages of the southeastern United States. Nautilus-Sanibel. 119 (1), 1-10 (2005).
Williams, J. D., Butler, R. S., Warren, G. L., Johnson, N. A. . Freshwater mussels of Florida. , (2014).
Jirka, K. J., Neves, R. J. Reproductive biology of four species of freshwater mussels (Molluscs: Unionidae) in the New River, Virginia and West Virginia. Journal of Freshwater Ecology. 7 (1), 35-44 (1992).
Watters, G. T., O’Dee, S. H., Chordas, S. Patterns of vertical migration in freshwater mussels (Bivalvia: Unionoida). Journal of Freshwater Ecology. 16 (4), 541-549 (2001).
Richardson, F., Martínez, P. Anodonta propagation studies: determination of mussel sexual maturity and Glochidia release agents. Proceedings of the Gulf and Caribbean Fisheries Institute. 48, 535-538 (2004).
Heinricher, J. R., Layzer, J. B. Reproduction by individuals of a nonreproducing population of Megalonaias nervosa (Mollusca: Unionidae) following translocation. The American Midland Naturalist. 141 (1), 140-148 (1999).
Watters, G. T., O’Dee, S. H. Glochidia of the freshwater mussel Lampsilis overwintering on fish hosts. Journal of Molluscan Studies. 65 (4), 453-459 (1999).
Hastie, L. C., Young, M. R. Timing of spawning and glochidial release in Scottish freshwater pearl mussel (Margaritifera margaritifera) populations. Freshwater Biology. 48 (12), 2107-2117 (2003).
Galbraith, H. S., Vaughn, C. C. Temperature and food interact to influence gamete development in freshwater mussels. Hydrobiologia. 636 (1), 35-47 (2009).
Kobayashi, O., Kondo, T. Reproductive ecology of the freshwater pearl mussel Margaritifera togakushiensis (Bivalvia: Margaritiferidae) in Japan. Venus (Japan). 67 (3-4), 189-197 (2009).
Shea, C. P., Peterson, J. T., Wisniewski, J. M., Johnson, N. A. Misidentification of freshwater mussel species (Bivalvia: Unionidae): contributing factors, management implications, and potential solutions. Journal of the North American Benthological Society. 30 (2), 446-458 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Beaver, C. E., Geda, S. R., Johnson, N. A. Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida). J. Vis. Exp. (152), e60244, doi:10.3791/60244 (2019).