מדביק עכברים עם מלאציה spp כדי ללמוד את האינטראקציה עם הפטרייה-מארח

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה נעשו בהתאם לפקודה על הטיפול באורגניזמים במערכות הכלולות של המשרד הפדרלי לסביבה, שוויץ (www.bafu.admin.ch). ניסויים בעכבר נערכו בהתאמה קפדנית עם ההנחיות של חוק הגנת בעלי חיים שוויצרי ובוצעו תחת הפרוטוקולים שאושרו על ידי הלשכה הוטרינרית של הקנטון ציריך, שוויץ (רישיון מספר 168/2018). 1. טיפוח מאלאזיה בתנאי מעבדה הערה: יש לאחסן את כל החומרים הריאגנטים והמדיה המשמשים לפרוטוקול זה בטמפרטורת החדר (RT, 20 – 25 ° c) אלא אם כן צוין אחרת, כאשר הטמפרטורה התחתונה יכולה לעכב את הצמיחה פטרייתי. מכינים את המדיום הנוזלי של דיקסון (mDixon) לצמיחת מאלאזיה . כדי להכין 500 mL של מדיום נוזלי mDixon, לפזר 18 g לחלץ מאלט, 10 גרם מיובש שור-מרה, 5 מ ל רצף-40, 3 גרם Peptone, 1 מ ל גליצרול ו 1 mL חומצה אולאית ב 500 mL מזוקקים H2o (dH2o). להתאים את המדיום ל-pH 6 עם HCl ו החיטוי. אחסן את המדיום ב-RT. הכן mDixon אגר צלחות על ידי הוספת 7.5 g אגר כדי 500 mL mDixon בינונית לפני אוטוקלינג. לאט לצנן את mDixon אגר לאחר אוטוקלינג באמצעות בר היגוי צלחת חימום מגנטי כדי למנוע מיצוק חלקי של המדיום בזמן הקירור. לאחר שאגר התקרר עד 50-60 ° c, מוותר על הנוזל לתוך מנות פטרי במכסה של זרם למינארי ומאפשר להם להתייבש ב-RT בלילה.הערה: לוחות אגר ניתן לאחסן ב 4 ° צ’ במשך מספר שבועות כאשר עטוף ושמור הפוך כדי למנוע אידוי. השיגו את הליאציה והחייה את המניות של מאלאזיה על פי ההוראות שהושגו על ידי המתווכת. האיחסן 10 מ ל של מדיום נוזלי mDixon ב סטרילי 100 mL Erlenmeyer בקבוקון עם השעיית מלאסזיה לתחייה על פי ההוראות שהושגו על ידי הספק. מודאת התרבות באינקובטור רועד ב 30 ° צ’ ו 180 סל ד. לבחון את צמיחת התרבות המלאזיה באופן סדיר על ידי בדיקת המראה של צבע קרם ועכירות. הקינטיקה של הצמיחה תלויה במין ובזן של מלאסזיה , והיא עשויה להיות איטית במיוחד כאשר מלאסזיה טרייה לאחר שקמה מהמלאי. (איור 1א). להכין מניות גליצרול על ידי ערבוב 3 חלקים של התרבות מאלאזיה בצפיפות בינונית mdixon עם 1 חלק של סטרילי 99% גליצרול. לתוך צינורות ברגים מעוקריםולחנות ב-80 ° c. עבור הפצת החוץ הגופית, צלחת מלאסזיה מן התרבות הנוזלית של mdixon או מתוך מלאי גליצרול קפוא על צלחת mdixon אגר (הביא RT מ 4 ° c) באמצעות לולאת החיסון.הערה: העברה לוחות mDixon אגר כדי RT מ 4 ° צ’ לפני השימוש, מאז קר mDixon אגר מעכב צמיחה פטרייתי. הפוך את הצלחת אגר (s) עם מלאזיה הפוכה בחממה (לא רועדת) ב 30 ° c. בדקו את התפתחותם של מושבות מאלאזיה באופן סדיר.הערה: מושבות מלאסזיה על לוחות mdixon אגר מופיעות בתוך 3-5 ימים והם בצבע קרם משעמם, חלק עם העלאה קמורה (איור 1B). חנות המושבות של מלאסזיה על הצלחות של mdixon אגר בשעה RT במשך ~ 2 שבועות. לאחר מכן, הכינו צלחת חדשה של mDixon אגר על ידי מלטציה מתוך מלאי הגליצרול הקפוא כפי שמתואר ב1.7. 2. הכנת האינוניות להידבקות בעכברים האיחסן 10 מ ל של מדיום נוזלי mDixon בקבוקון 100 mL סטרילי Erlenmeyer אייר עם 3-5 בודדים מושבות מלאסזיה מצלחת של mdixon אגר (ראה שלב 1, איור 1B). התרבות המלאבית עבור ~ 48 עד 96 h ב 30 ° צ’ ו 180 rpm עד התרבות היא בצבע קרם ו נחל דלוח (איור 1א).הערה: הזמן הדרוש לצמיחת מלאזיה תלוי במינים ובזנים של המלאזיה ובכמות הפטריה המשמשת לחיסון. העברה 2 מ ל של התרבות mal, לתוך שפופרת סטרילי 2 מ”ל מיקרוצנטריפוגה ו צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 10, 000 x g. להיפטר supernatant ולשטוף את הגלולה על ידי השעיית אותו ב 1 מ ל של תמיסת מלח באגירה של פוספט (PBS). צנטריפוגה שוב עבור 1 דקות ב 10, 000 x g. לאחר הכביסה, להשעות את הגלולה ב 1 mL של PBS ידי ליטוף נמרץ למדוד את הצפיפות האופטית של הפתרון ב 600 ננומטר (ODA600) באמצעות ספקטרומטר. לדלל את ההשעיה מלזיה 20 – 50 x עם PBS עבור מדידה OD כדי להבטיח כי הקריאה היא בין 0.1 ו 1.הערה: הצפיפות של תרבות בת 3 ימים של מאלאזיה משתנה בדרך כלל בין 15 ל-30 ODA600, בהתאם למינים המאלכזיה ולמתח ולמספר תאי שמרים המשמשים לחיסון התרבות (שלב 2.1). מלאסזיה נוטה ליצור אגרגטים, לכן, ליטוף נמרץ הכרחי כדי להבטיח הומוגניות של ההשעיה. מחלק את הנפח של ההשעיה מלאסזיה ב-PBS שמתאים צפיפות של 4 ODA600 לתוך צינור סטרילי 2 מ ל. הכינו צינור 1 לכל בעל חיים להידבק. צנטריפוגה את הצינורות המכילים מאלאזיה עבור 1 דקות ב 10, 000 x g. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה mal, ב 200 μl של שמן זית יליד (מתאים 2 ODA600 שמרים תאים/100 μl שמן זית).הערה: שמן זית נמצא כרכב טוב לזיהום אפיטנאני עם מאלאזיה, כאשר מלאשזיה הוא שמרים תלויי-ליפופילית ושומנים בשומנים. שמן זית נספג טוב יותר על ידי העור מאשר PBS. עם זאת, יש לזכור כי לא קל להשעות את מלאשזיה בשמן זית. שפר את ההאשזיה/שמן זית מושעה על ידי vortexing. לשמור על ההשעיה ב-RT עד שהוא משמש לזיהום. הכינו צינורות עם שמן זית בלבד לזיהום מבוים של בעלי חיים בשליטה. 3. הדבקת עכברים עם מלאזיה הזמנת נקבה C57BL/6 עכברים בגיל של 6-8 שבועות ולאפשר להם לתקן במתקן החיות הניסיוני לפחות שבוע אחד. חשב עבור 3-5 עכברים לכל קבוצה, כולל קבוצת בקרה לא נגוע. הכנת קוקטייל סטרילי הרדמה המכיל 1.3 mg/mL Xylazine ו 6.5 mg/mL קטמין ב-PBS. 5 מ ל של קוקטייל ההרדמה מספיק כדי לעבור 20 חיות. התאימו את עוצמת הקוקטייל בהתאם למספר החיות המורדם. בעלי חיים על ידי הזרקת 10 μL/g משקל גוף של קוקטייל הרדמה intraperitoneally (מתאים 65 mg קטמין ו -13 מ”ג Xylazine למשקל הגוף) ומניחים את החיות מורדם על משטח חימום ב 37 ° c.הערה: במינון שצוין, בעלי חיים בדרך כלל נשארים מורדם עבור ~ 30-60 min. בדוק את הרפלקסים על ידי צובט את הרגל האחורית עם מלקחיים כדי להבטיח כי בעלי חיים מורדם לחלוטין. החלת קרם עיניים על העיניים כדי למנוע התייבשות במהלך ההרדמה. באופן אופציונלי, למדוד את עובי האוזן של שתי האוזניים באמצעות קליבר (0-5 מ”מ טווח). למדוד שני אזורים שונים של כל אוזן ולחשב את עובי האוזן הממוצעת לכל אוזן.הערה: מדידת עובי האוזן היא אופציונלית ותלויה בשאלת המחקר. עם זאת, אם עובי האוזן משמש כבדיקה עבור דלקת העור, יש צורך למדוד את עובי האוזן הבסיסית לפני זיהום. (ראה שלב 4). באופן אופציונלי, לשבש את המכשול באפידרמיס של עור האוזן החוזרת על ידי סרט מתון להתפשט: להחיל ידנית פיסת נייר קטנה על העור ולהסיר אותו שוב. חזור על 5 סיבובים רצופים תוך שימוש בנייר דבק טרי לכל סיבוב.הערה: מלאזיה גורמת לדלקת עור בולטת יותר בעור המכשול בהשוואה לעור בלתי מודאג (איור 2א)7. למריחה על התינוק להחיל 100 μL (2 ODA600) של האאשזיה/שמן זית הבולם על הצד השני של כל אוזן באמצעות פיפטה סטרילי. כלול קבוצת בקרה של בעלי חיים המטופלת בשמן זית בלבד (קבוצת בקרה המטופלת ברכב).הערה: מערבולת המאשזיה/שמן זית מושעה במרץ על מנת להבטיח השעיית מלציה הומוגנית מיד לפני הבקשה. הניחו לבעלי החיים המורדם על משטח החימום להימנע מהיפותרמיה עד שהם מראים סימנים של התאוששות (תנועת הקצפת, קצב נשימה מוגבר וכו ‘). הכנס 200 μL של התמיסה סטרילי ומחומם מראש 2% תת-עורי לתוך קיפול הסוף כדי לתמוך בחילוף החומרים שלהם ולחות מחדש.הערה: כדי להכין תמיסה סטרילית 2% גלוקוז, לפזר 1 מ”ג גלוקוז ב 50 mL PBS ולסנן אותו באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר. ניתן לאחסן את הפתרון ב -4 ° c. להעביר את החיות. בחזרה לכלוב שלהם 4. ניתוח מלאזיה-דלקות עור מושרה הערה: הליך זה מתאראת הניתוח של נפיחות באוזן הנגרמת במהלך זיהום המשמש כפרמטר של דלקת בעור. תנאי מוקדם לניתוח נפיחות האוזן הנגרמת על ידי פטריה היא למדוד את עובי האוזן הבסיסית לפני הקלטת-להתפשט ו/או זיהום (שלב 3.5). הכינו את החדר הארוך להרדמה לטווח קצר של מאלאזיה-בעלי חיים נגועים ושליטה. העבר חיה אחת בזמן לחדר והמתן עד שהחיה תהיה מורדם לגמרי.הערה: סימנים של הרדמה נכונה כוללים הרפיה גופנית מלאה, כמו גם איטית וכבדה (האגף) נשימה. לעקוב בזהירות הרדמה כחשיפה מורחבת של isofלאנה יכול להיות קטלני. מוציאים את החיה מהתא ומניחים אותו על הרקמה. למדוד את עובי האוזן (של) באמצעות קליבר (טווח 0-5 מ”מ). למדוד שני אזורים שונים של כל אוזן ולחשב את עובי ממוצע לכל אוזן (ראה שלב 3.5). . להעביר את החיה חזרה לכלובהערה: הרדמה Isofלוריאן היא קצרת מאוד, ובעלי החיים להתאושש בתוך ~ 30 לאחר ההסרה מהתא isofלאנה. לחשב את הגידול בעובי האוזן על ידי הפחתת עובי האוזן הממוצעת הבסיסית, נמדד לפני הקלטת להתפשט ו/או זיהום, מן עובי האוזן הממוצעת נמדד בכל נקודה לאחר ההדבקה. התווה את הערכים המחושבים כגידול בעובי האוזן או, לחילופין, כמו עובי האוזן הכולל לאורך זמן עבור כל בעל חיים או קבוצת בעלי חיים (איור 2ב’). 5. ניתוח העמסה של פטריות בעור הנגוע הכינו צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 2 מ ל עבור כל אוזן להיות נקצרו, המכיל 0.5 mL של וסטרילי 0.05% NP40 ב dH2O ו כדור פלדה אוטוקלבד (5 מ”מ קוטר). שוקלים את הצינורות באמצעות איזון מדויק וכותבים את המשקל המדויק. המתת חסד העכברים על ידי שיתוף2 חנק. הסר את האוזן (ים) בבסיס והעבר לתוך הצינור המכיל 0.5 mL של מ0.05% NP40 ב dH2O, כפי שמתואר בשלבים 5.1-5.2. שוקלים את הצינורית המכילה את רקמת האוזן ומחשבים את המשקל הממשי של כל מדגם על ידי הפחתת משקל הצינורית ללא איבר ממשקל הצינורית עם העוגב. הומוגון רקמת האוזן במשך 6 דקות ב -25 הרץ באמצעות מכשיר הומוגניזציה ברקמה. ודא כי הרקמה היא הומוגניים היטב. צלחת 100 μL של כל מדגם (המתאים ל 1/5 של כל הומוגון, דילול פקטור = 5) אל mDixon אגר צלחות ומודקת את הצלחות הפוכה בחממה 30 ° c.הערה: יש לכוונן את כמות הציפוי המגון בהתאם לעומס הפטרייתי הצפוי. הקפד על הלוח מספיק הומואט להשיג לפחות 10 ולא יותר מ 250 מושבות לכל צלחת כדי לאפשר ספירה קלה. באופן אופציונלי, צלחת לוחות מרובים לכל מדגם עם דילול שונה של הומואט. בדקו את התפתחותם של מושבות מאלאזיה באופן סדיר.הערה: המושבות בדרך כלל הופכות לגלויות לאחר 2-3 ימים. הזמן הדרוש למושבות מלאציה לצמוח תלוי במין ובזן של מאלאזיה. . תספור את המושבות לצלחת חשב את מספר רקמת ה-CFU/g באמצעות הנוסחה הבאה:CFU/g רקמה = (מספר של מושבות/צלחת) x (גורם דילול)/(משקל של דגימת העור ב g).הערה: ניתן להעריך את מגבלת הזיהוי המינימלית המשוערת באמצעות הנוסחה הבאה: מגבלת זיהוי מינימלית = (מושבה אחת/צלחת) x (משקל ממוצע של כל דגימות העור ב-g). עומסים פטרייתיים מותווים בדרך כלל בקנה מידה לוגריתמי (איור 2ג).