Infizieren von Mäusen mit Malassezia spp. zur Untersuchung der Pilz-Host-Interaktion
Summary
Dieses Protokoll skizziert die Etablierung eines Mausmodells für das Studium von Malassezia-Host-Interaktionenin der Haut. Es beschreibt die Kultivierung von Malassezia in vitro, die Infektion der murinen Haut mit Malassezia, und die anschließende Analyse der Entzündung und der Pilzbelastung im Hautgewebe.
Abstract
Tiermodelle sind für die Erforschung von Infektionskrankheiten von entscheidender Bedeutung. Sie bilden eine wichtige Grundlage für die Analyse des gesamten Spektrums von Wechselwirkungen, die zwischen Mikroben und ihrem Wirt in vivo auftreten, auf gewebespezifische Weise. Pathogene Pilze werden zunehmend als ernste Bedrohung für den Menschen erkannt und die Nutzung solcher Infektionsmodelle hat unser Verständnis der Pilzpathogenität erheblich verbessert. Arten der Gattung Malassezia sind die am häufigsten vorkommenden Pilze der menschlichen Haut mikrobiota und sie sind auch mit der Entwicklung von schweren entzündlichen Hauterkrankungen wie seborrhoische Dermatitis und atopische Dermatitis verbunden. Ein ursächliches Verhältnis zwischen Malassezia und Krankheitspathogenese bleibt jedoch unbekannt, eine Tatsache, die auf die schlechte Kenntnis des komplexen Übersprechens von Malassezia mit dem Hautimmunsystem zurückzuführen ist. Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines experimentellen Mausmodells, das es ermöglicht, die Wechselwirkung von Malassezia mit der Säugetierhaut in vivo zu untersuchen. Es skizziert die Methode zur Kultivierung von Malassezia spp. unter Laborbedingungen, wie man die murine Haut mit Malassezia spp. infiziert und wie man das Ergebnis einer Infektion mittels der Hautentzündung und Pilzbelastungsanalysen bewertet. Das hier beschriebene Modell funktioniert bei vollständig immunkompetenten Tieren und setzt nicht auf immunsuppressive oder antibiotische Vorbehandlung der Tiere. Darüber hinaus ist es an nahezu alle gentechnisch veränderten Mausstämme anpassbar und kann mit anderen Hautkrankheitsmodellen kombiniert werden. Diese Eigenschaften machen dieses Infektionsmodell zu einem sehr leistungsfähigen Werkzeug, um die angeborene und adaptive Immunantwort des Wirts gegen Malassezia in der Haut in vivo im Detail zu untersuchen.
Introduction
Die Haut wird von vielen verschiedenen Mikroben bevölkert. Die ständige Exposition der Haut gegenüber der Mikrobiota trägt zur Gestaltung und Erziehung des Immunsystems des Wirts bei. Pilze werden zunehmend als ein wichtiger Teil der Mikrobiota anerkannt und sie erfüllen eine wichtige Rolle für die Wirt Physiologie und Immunität, ähnlich wie Bakterien und Viren1. Arten der Gattung Malassezia sind bei weitem die am häufigsten vorkommenden Pilze, die die Haut von warmblütigen Wirbeltieren besiedeln und sie machen mehr als 90% der menschlichen Haut Mycobiom2,3aus. 18 verschiedene Arten von Malassezia wurden bisher aus der menschlichen und tierischenHaut4 identifiziert.
Verschiedene Pathologien der Haut werden gedacht, um, zumindest teilweise, als Folge einer dysbalanced Mikrobiota Zusammensetzung entstehen. Dysbiose kann zum Überwachsen von Arten mit pathogenem Potenzial führen, was zu opportunistischen Infektionen und Krankheit5. Konsequenterweise gibt es einen zunehmenden Beweis dafür, dass Malassezia,neben seinem commensal Lebensstil, trägt zur Entwicklung von verschiedenen Hautpathologien, von Schuppen und Pityriarsis versicolor zu schwereren entzündlichen Erkrankungen wie als seborrhoische Dermatitis und atopische Dermatitis4,6. Während ein ursächlicher Zusammenhang zwischen Malassezia und pityriarsis versicolor hergestellt wurde, bleibt die pathophysiologische Rolle des Pilzes bei schwereren Hautpathologien weitgehend unbekannt.
Die Bestimmung der Rolle von Malassezia bei Hauthomöostase und Krankheit erfordert ein tieferes Wissen über die Wechselwirkung des Pilzes mit der Haut und dem hautförmigen Immunsystem. Bemerkenswert ist, dass die Forschung an Malassezia im Vergleich zu anderen menschlichen Pilzpathogenen (z. B. Candida albicans oder Aspergillus fumigatus) noch im noch jungen Stadium ist. Dies ist auf die Schwierigkeit bei der Kultivierung von Malassezia unter Laborbedingungen und das Fehlen geeigneter experimenteller Modelle zur Untersuchung des Pilzes in Kontakt mit dem Wirt in vivo zurückzuführen. Frühere Experimente mit isolierten Zellen in der Kultur zeigten eine breite Palette von direkten und indirekten Wechselwirkungen zwischen Malassezia und verschiedenen Immun- und Nichtimmunzellen7. Diese In-vitro-Experimente rekapitulieren jedoch nur teilweise die Situation der komplexen Hautumgebung in vivo, wo zahlreiche zelluläre und molekulare Ereignisse gleichzeitig zwischen dem Pilz und verschiedenen Zelltypen auftreten.
Hierin skizzieren wir das Protokoll für ein experimentelles Modell der Malassezia-Hautinfektion bei Mäusen, das wir vor kurzem eingerichtet haben, um die Pilz-Wirt-Interaktion in vivo7zu untersuchen. Dazu gehören Verfahren für (1) die erfolgreiche Kultivierung von Malassezia in vitro, (2) die epikutane Anwendung von Malassezia auf die murine Ohrhaut und (3) die technischen Details zur Analyse der Malassezia-induziertenHaut. Entzündung und die Pilzbelastung der infizierten Haut. Wichtig ist, dass dieses Modell nicht auf Immunsuppression (z. B. durch Kortikosteroide) oder Antibiotika-Behandlung von Mäusen vor der Infektion angewiesen ist, wie es in anderen Mausmodellen der Pilzinfektion8,9praktiziert wird. Im Gegenzug ermöglicht es das Studium des gesamten Spektrums der angeborenen und adaptiven Immunantwort gegen Malassezia in der normalen Haut. Bemerkenswert ist, dass inzuchtfreie Mäuse, die unter bestimmten pathogenfreien (SPF)-Bedingungen gehalten werden, nicht von Natur aus mit Malassezia kolonisiert werden und daher ihre Exposition gegenüber dem Pilz nicht zu einer anhaltenden Kolonisation führt, sondern vom Wirt innerhalb ca. 1,5 Wochen. Das Modell ermöglicht jedoch die Untersuchung der Mechanismen der Antimykotika-Wirtsreaktionsinitiierung und -regulierung, die wiederum die Grundlage dafür ist, wie Immungedächtnis erzeugt wird. Das Modell ist vielseitig, da es leicht auf eine Vielzahl von genetisch veränderten Mausstämmen angewendet werden kann und es mit anderen bestehenden Hautkrankheitsmodellen kombiniert werden kann, wie Modelle von Barrieremangel, um die Auswirkungen von Malassezia unter pathologische und entzündliche Hauterkrankungen7. Daher bietet das beschriebene Modell der experimentellen Malassezia-Hautinfektion bei Mäusen ein hohes Maß an Flexibilität, um die Wechselwirkung des Pilzes mit dem Immunsystem der Haut im Kontext von Homöostase und Krankheit zu untersuchen.
Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Hautinfektion von Mäusen mit Malassezia spp. Aufgrund ihres pathogenen Potenzials werden Malassezia spp. in einigen Ländern, einschließlich der Schweiz, als BSL2-Erreger eingestuft. Bitte überprüfen Sie die lokalen Richtlinien und befolgen Sie die Vorschriften der lokalen Behörden. BSL2-klassifizierte Organismen sollten von geschultem Personal in einem BSL2-zertifizierten Biosicherheitsschrank (BSC) behandelt werden. Biologische Abfälle, die mit BSL2-klassifizierten Organismen kontaminiert sind, sowie Schlachtkörper von Mäusen, die mit solchen Organismen infiziert sind, sollten vor der Entsorgung autoklaviert werden. Bei Experimenten mit Mäusen sollten alle Anstrengungen unternommen werden, um Leiden zu minimieren und die höchsten ethischen und humanen Standards nach den 3R-Prinzipien (ersetzen, verfeinern, reduzieren) zu gewährleisten10. Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden mit M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) und M. sympodialis (ATCC 42132)7durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Infektion der Haut des häufig verwendeten Inzucht-Mausstamms C57BL/6 durch Malassezia spp. Anpassung dieses Protokolls an andere Mausstämme mit einem anderen genetischen Hintergrund (z.B. Balb/c) oder an gentechnisch veränderte Maus Stämme können eine Anpassung der Infektionsdosis, des Zeitpunkts(der Analyse) usw. benötigen. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, sollten Mäusegruppen immer das gleiche Alter und Geschlecht haben. Die Quelle der Mäuse sollte stabil gehalten werden, da selbst geringfügige Veränderungen des genetischen Hintergrunds und Unterschiede in der Mikrobiota, die zwischen Anbietern existieren und sogar zwischen verschiedenen Einheiten einer einzigen Zuchtanlage existieren können, unvorhersehbare Auswirkungen auf die Infektionsverlauf. Bei der Einrichtung des in diesem Protokoll beschriebenen Malassezia-Infektionsmodells wird empfohlen, eine Pilotstudie durchzuführen, um den Infektionsverlauf sorgfältig zu überwachen, einschließlich des Ausmaßes der Besiedlung, der Kinetik der Pilzclearance und des Grades der Entzündungen und Pathologie, die induziert werden könnten (z. B. wenn die Ohrenhaut vor der Infektion barrierefrei ist), um die optimalen Assay-Bedingungen zu bestimmen.
Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und Unterschiede zwischen Versuchsgruppen zuverlässig zu erkennen, muss die Anzahl der pro Gruppe verwendeten Tiere auf der Grundlage der statistischen Analyse berechnet werden. Der Stichprobenumfang wird auf der Grundlage von Effektgröße, Fehlerquote und Leistung berechnet, die biologische und experimentelle Schwankungen berücksichtigen (z. B. aufgrund von Schwankungen im Immunsystem). Vermeiden Sie es aus ethischen Gründen, unnötig viele Tiere zu verwenden. In Bezug auf Malassezia Hautinfektion, Behandlung nur ein Ohr mit dem Pilz und mit dem anderen Ohr als Kontrolle innerhalb der gleichen Maus, ist nicht ratsam, weil Mäuse den Pilz auf beide Ohren verbreiten können, während der Pflege. Die Verwendung von 1/2 Ohr für verschiedene methodische Auslesevorgänge wie die Bestimmung der Pilzbelastung, die Isolierung von Immunzellen oder die histologische Analyse reicht jedoch oft aus und führt zu einer signifikanten Verringerung der für Experimente verwendeten Tierzahlen.
18 verschiedene Malassezia-Arten wurden bis heute beschrieben. Inter- und Intraspezies-Variationen innerhalb der Gattung Malassezia können die Interaktion mit dem Wirt beeinflussen, wie wir auch aus Studien über andere menschliche pathogene Pilze gelernt haben13. Verschiedene Malassezia-Arten und -Stämme unterscheiden sich in ihrer Herkunft (z.B. m. pachydermatis ist die häufigste Tierart, während M. restricta, M. globosa und M. sympodialis die am häufigsten isolierten Arten sind. prominente Mitglieder des Pilzhautmikrobioms beim Menschen mit variabler Verteilung dieser Arten auf verschiedene Hautbereiche). Einige Arten wurden mit Commensalismus in Verbindung gebracht, während andere als pathogener angesehen werden, obwohl detaillierte Beweise relativ schwach bleiben. Wichtig ist, dass einige Arten und Stämme von Natur aus schwieriger zu züchten sind als andere. Daher muss die Entscheidung, welche Art/Sorte für die Infektion verwendet werden soll, auf der Forschungsfrage beruhen.
Experimentelle Infektion der murinen Haut mit einigen mikrobiellen Organismen wie Candida albicans oder Staphylococcus aureus erfordern die Störung der epidermalen Barriere vor der Infektion, z.B. mit Sandpapier14, 15,16. Im Gegensatz dazu ist das hier beschriebene Modell der Malassezia-Infektion ebenso effizient mit und ohne Barrierestörung7. Der Grad der Entzündung durch den Pilz induziert wird massiv erhöht, wenn die Haut vor der Infektion bandabgetragen wird7. Ob die Haut vor der Anwendung von Malassezia manipuliert werden sollte, hängt daher von der Forschungsfrage ab. Es gibt verschiedene Modelle chronischer und akuter Hautentzündungen (z.B. Modelle für verzögerte Typüberempfindlichkeit (DTH) und Kontaktüberempfindlichkeit (CHS)) und Modelle von Barrieremangel, die für die Untersuchung des Beitrags von Commensalhefe von Interesse sein können. Hautpathologien.
Inzuchtmäuse, die unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten werden, werden (nach unserem Wissen) nicht natürlich mit Malasseziakolonisiert. Daher stellt die experimentelle Anwendung von Malassezia auf die Mausohrhaut eine primäre Exposition gegenüber dem Pilz dar, die eine akute Reaktion im Wirt induziert, was wiederum zu einer Pilzfreiheit innerhalb von 1 – 2 Wochen7führt. Während das in diesem Protokoll beschriebene Modell daher nur teilweise die Situation bei immunkompetenten Menschen oder anderen Wirtsorganismen widerspiegelt, die dauerhaft mit Malasseziabesiedelt sind, ermöglicht die experimentelle Infektion ein großes Möglichkeit, die antimykotische Immunität und die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die dieser Reaktion zugrunde liegen. Es ermöglicht auch die Untersuchung von Variationen in der Reaktion auf verschiedene Malassezia Arten und Stämme unter verschiedenen experimentellen Bedingungen (z. B. mit und ohne BarriereStörung der Haut).
Die Studie von Malassezia – Wirtsinteraktionen beschränkte sich in der Vergangenheit auf In-vitro-Experimente mit isolierten Zelltypen in Kulturen (z. B. Keratinozytenzelllinien, PBMCs). Obwohl diese Studien einige Sendemittel auf Pilz- und Wirtsdeterminanten werfen, die das Zusammenspiel zwischen Malassezia und dem Wirt17prägen, erlauben sie es nicht, ein umfassendes Verständnis des Pilzes zu erlangen – Wirtsinteraktion im Komplex Umgebung der Haut, die mehrere Zelltypen umfasst, die in ständiger Kommunikation sind, wie Keratinozyten, Fibroblasten und geweberesidente Immunzellen, aber auch Leukozytenpopulationen, die das Gewebe nur bei mikrobiellem Haut. Dieses mehrzellige Netzwerk kann nicht vollständig in den In-vitro-Modellen reproduziert werden, selbst bei den meisten fortschrittlichen Organoidsystemen. So stellt die experimentelle Infektion von Mäusen immer noch den Goldstandard in der Immunologie und Infektionskrankheitsforschung dar, und die Verfügbarkeit des hier beschriebenen Modells stellt einen Durchbruch auf dem Gebiet der Malassezia-Forschung dar. Wichtig ist, dass dieses Modell auf der epikutanen Anwendung von Malassezia auf der ansonsten ungestörten Mausohrhaut beruht und nicht die Inokulation des Pilzes durch Injektion in das Gewebe impliziert, z. B. subkutan oder intraperitoneal, Frühere Studien berichteten18, die beide weiter von der Situation bei natürlich kolonisierten Wirten entfernt sind.
Die Möglichkeit, das in diesem Protokoll beschriebene Modell der Malassezia-Infektion mit anderen verfügbaren Mausmodellen zu kombinieren, erhöht den Umfang und die Flexibilität der Anwendung erheblich. Letztere umfassen verschiedene Modelle spezifischer Hauterkrankungen, wie das Modell des Barrieremangels, das wichtige Merkmale der atopischen Dermatitis imitiert, einer Krankheit, die mit Malassezia bei Menschen und Hunden verbunden ist. Darüber hinaus kann eine epikutane Infektion der Haut mit Malassezia leicht auf Mäuse mit genetischen Defekten in Wirtsgenen von Interesse angewendet werden, oder an Mäusen, bei denen eine Zellart von Interesse genetisch gelöscht oder pharmakologisch erschöpft werden kann (z. B. durch Diphtherietoxin-Verabreichung bei Diphtherietoxin-Rezeptor-exemitten Mäusen). Solche Modelle stellen ein unvermeidliches Werkzeug dar, um die Wirtsreaktion auf kominsale und pathogene Mikroben, einschließlich Malassezia, zu sezieren und die Rolle dieser Gene und Zelltypen in der Pilz-Wirt-Interaktion zu bewerten. Die Analysen der Malassezia-Host-Hautinteraktionkönnen weit über das in diesem Protokoll beschriebene Maß hinaus erweitert werden. Dazu gehören Analysen durch Histologie (z.B. zur Bestimmung des Grades der Hautpathologie oder der epidermalen Verdickung, die durch den Pilz induziert wird), durch immunhistochemie oder immunfluoreszierende Färbung von Gewebeabschnitten mit Antikörpern, die gegen den Zelltyp gerichtet sind. bestimmten Markern oder anderen Molekülen von Interesse. Es kann auch die Isolierung von Zellen (z. B. Gewebe-Resident oder Gewebe-infiltrierende Leukozyten-Teilmengen) aus dem infizierten Hautgewebe beinhalten, um die Polarisation, Regulierung und Dynamik der Immunantwort auf Malassezia in großer Tiefe zu untersuchen.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Universität Zürich, Schweiz, unterstützt.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | – | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | – | – | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | – | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
Referencias
- Iliev, I. D., Leonardi, I. Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).
- Findley, K., et al. Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).
- Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).
- Theelen, B., et al. Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment. Medical Mycology. 56, 10-25 (2018).
- Williams, M. R., Gallo, R. L. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).
- . . Malassezia and the Skin. , (2010).
- Sparber, F., et al. The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Solis, N. V., Filler, S. G. Mouse model of oropharyngeal candidiasis. Nature Protocols. 7 (4), 637-642 (2012).
- Russel, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Wu, G., et al. Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin. PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).
- Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).
- Schonherr, F. A., et al. The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity. Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).
- Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
- Liu, H., et al. Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses. Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).
- Nakagawa, S., et al. Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).
- Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin. Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).
- Yamasaki, S., et al. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).
