Misurazione dell'attività della chitinasi nei campioni biologici

La chitina è il secondo polisaccaride più abbondante sulla terra dopo la cellulosa, servendo come componente strutturale principale di una varietà di organismi tra cui l’esoscheletro di insetti, funghi, lieviti e alghe; alcuni vertebrati hanno anche la chitina¹. Le chitinasi sono una famiglia di enzimi che sono in grado di abbattere la chitina e sono altamente conservati durante tutta l’evoluzione in specie che vanno dai batteri ai mammiferi^2,3. Oltre alle chitinasi, i mammiferi hanno anche proteine simili alla chitinasi che sono simili alle chitinasi nella loro capacità di legare la chitina, ma differiscono in quanto mancano di capacità enzimatica di fendere la chitina^{4 .}

Anche se le chitine e le chitinasi sono state studiate da tempo, con indagini risalenti ai primi anni del 1900, l’attenzione principale è stata sul loro ruolo negli insetti e in altri invertebrati. Infatti, non è stato fino al 1960, quando i vertebrati sono stati trovati ad avere chitinasi a tutti. Utilizzando un saggio a base di chitobiasi, è stato dimostrato che le chitinasi si trovano nel tratto digestivo di un certo numero di vertebrati, tra cui lucertole e merli, un’osservazione ipotizzata sia dovuta al consumo di organismi contenenti chitina come gli insetti⁵ .

I mammiferi hanno due forme enzimaticamente attive di chitinasi: chitinasi dei mammiferi acidi (AMCase, noti anche come CHIT2 e CHIA) e chitotriosidasi (CHIT1)⁴. Entrambe queste proteine sono in grado di chitina idrolmente. Tuttavia, CHIT1 è più enzimaticamente attivo negli esseri umani, dove quasi tutta l’attività della chitinasi è derivata da CHIT1. ⁴ Nei topi, sia Chit1 che AMCase contribuiscono quasi equamente all’attività complessiva della chitinasi⁶. D’altra parte, le proteine simili alle chitinasi non hanno attività di chitinasi.

Chit1 è principalmente secreto dai macrofagi ed è spesso considerato una risposta immunitaria agli agenti patogeni contenenti chitina⁷. È stato anche dimostrato che l’enzima è coinvolto nella maturazione dei monociti in sottotipi di macrofagio M1 e M2, anche senza la presenza del substrato chitina⁸. Inoltre, può anche essere coinvolto nella maturazione di altre cellule immunitarie tra cui cellule T helper di tipo 2 (Th2) ed eosinofili, come è stato dimostrato di essere il caso in infezione polmonare criptococcale⁹. Questi studi indicano un ruolo complesso delle chitinasi nel sistema immunitario.

Negli ultimi anni, i livelli di Chit1 sono stati trovati come un importante biomarcatore della progressione per oltre 40 diverse malattie umane, tra cui malattie da accumulo lisosomiale, malattie infettive, malattie respiratorie, malattie endocrinologiche, malattie cardiovascolari malattie neurologiche e altre (riviste¹⁰). In molte di queste malattie, i livelli di Chit1 sono un forte predittore di gravità della malattia e l’efficacia terapeutica¹⁰.

Come chitinasi hanno guadagnato una reputazione come biomarcatore per numerose condizioni mediche tra cui malattia di Gaucher, strumenti e saggi sono stati sviluppati per facilitare i test per la presenza di chitinasi. I metodi più vecchi includono la procedura di Schales, un protocollo adattato da un test della glicemia e il metodo 3,5 dell’acido dinitrosalicilico (DNS). Tuttavia, questi metodi sono spesso sensibili al tempo e tecnicamente difficili¹¹. La procedura per entrambi questi test richiede la riduzione di ossidanti inorganici, ferricianide nel caso della procedura di Schales, ad esempio, producendo un cambiamento di colore che può essere misurato solo spettrofotometricamente. Inoltre, entrambi i test comportano una fase di riscaldamento o ebollizione che richiede tempo e necessaria per lo sviluppo del colore^12,13.

Descritto qui è un rapido e semplice saggio fluorimetrico per determinare i livelli di chitinasi nei campioni di mammiferi^14,15. Due dei campioni qui utilizzati includono fluidi di lavaggio del siero e del bronchoalveolar (BAL); L’attività della chitinasi è stata misurata anche in campioni di latte materno e urina, e la tecnica può essere eseguita in quel tipo di campioni così come in qualsiasi altro fluido biologico^16,17.