通过胚胎移植，生成具有突变倍体肢体的奇美体轴球
Summary
该协议的目标是使用胚胎组织移植技术，从Cas9诱变的供体组织中提取单倍体前肢的嵌合体轴片。
Abstract
越来越多的基因技术和资源使研究人员能够探索某些种类的蜥蜴（如阿索洛特人）在成年后再生整个四肢的能力的分子起源。在这里，我们概述了用于生成具有Cas9诱变性单倍体前肢的嵌合轴球的技术，可用于探索基因功能和肢体再生的保真度。我们将多种胚胎学和遗传技术相结合，包括通过体外活化、CRISPR/Cas9诱变生成和组织移植到一个协议中，在再生模型生物体中产生单倍体遗传筛选的独特系统。这种策略减少了肢体再生中基因功能分析所需的动物数量、空间和时间。这也允许研究其他基本过程（如器官形成、组织形态生成和其他基本胚胎过程）可能需要的基因的再生特定功能。本文描述的方法是在脊椎动物模型系统中进行单倍体遗传筛选的独特平台。
Introduction
从历史上看，两栖动物的胚胎组织移植一直是探索发育生物学和再生的基本机制的重要技术。axolotl是一种蜥蜴，在受伤或截肢后，具有再生组织和复杂结构（如四肢和器官）的惊人能力。同样令人印象深刻的是，他们可以在胚胎期、幼年期和成人期1、2、3接受其他个体的组织移植，而不会被拒绝。产生整个结构的胚胎区域，如四肢、尾巴、眼睛和头部，以及更特定的组织，如神经切除和索米特，可以在胚胎之间移植，以产生嵌合动物1，2，4，5，6。近一个世纪以来，对这种嵌合动物的研究为再生、组织分化、尺寸控制和模式1、7、8提供了重要的见解。
在过去的十年里，许多再生组织的转录研究已经产生了对基础蜥蜴再生9，10，11，12，13的遗传程序的见解。这些研究增加了候选基因的扩大列表，迄今为止，这些基因在再生背景下基本上没有特征。靶向诱变技术，如CRISPR/Cas，现在允许研究这种基因，这种基因方法大大促进了大轴醇基因组14，15，16的最近测序和组装。
我们寻求开发将经典发育生物学与新的基因技术相结合的技术，以解剖再生机制。产生单倍体胚胎的方法已经建立了几十年。虽然这些技术一直被认为是作为遗传模型生物18的蜥蜴的优势，但随后的遗传研究很少纳入单倍体动物。我们使用体外活化在axolotl生产单倍体胚胎，作为组织捐赠者移植19。利用携带荧光遗传标记的胚胎，我们设计了可靠的方法来生成几乎完全来自供体组织的四肢（图1A）。通过结合这两种技术，我们绕过了与单倍体相关的晚期胚胎杀伤力，允许生产完全发育的、移植的单倍体四肢（图1B，图1B’和图2）。
通过在移植前在单倍体胚胎中进行CRISPR/Cas介导的诱变，以产生具有突变单倍体四肢的嵌合体轴片，我们可以在肢体发育和再生的背景下专门研究基因功能。这允许从潜在的胚胎致命变异表型中拯救四肢。虽然CRISPR/Cas显微注射可以产生高度突变的动物，这类动物通常是高度马赛克，在目标部位14、20上保留一定程度的野生型等位基因和各种不同的突变。单倍体细胞中基于CRISPR的诱变增加单等位基因丧失功能突变的渗透，因为它们不能被保留的野生型等位基因掩盖。因此，在单倍体细胞系中基于CRISPR的筛选越来越多地用于研究许多细胞过程21、22、23的遗传基础。通过将基于CRISPR的谱系追踪与我们的单倍体肢体芽移植方案相结合，本文描述的方法可以作为活动物中单倍体遗传屏幕的平台。
Protocol
Representative Results
Discussion
在我们的协议中，有几个关键步骤用于生成单倍体-双倍体嵌合体，操作技术人员应考虑这些步骤，以便获得一致的嫁接结果。
单倍体生成失败的最可能原因是体外激活条件不佳。必须使用适当数量的活化精子来激活卵子。为了延长活力，精子样本应始终保持在4°C。在将任何精子样本涂在卵子上之前，使用倒置显微镜检查精子的存活性。完全非活动性精子绝不应使用，浓度应…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢凯瑟琳·罗伯茨对阿索洛特尔殖民地的关心。这项工作的资金由康涅狄格州创新再生医学研究基金（15RMA-YALE-09和15元人民币-YALE-01）和尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康和人类发展研究所（个人博士后）提供。奖学金 F32HD086942）。
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
Referencias
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Biología del desarrollo. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
- Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genética. 83 (4), 783-792 (1976).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome – scale CRISPR – Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. . Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Biología del desarrollo. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
