Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, axônios de neurônios pré-sinápticos navegar através de diversas regiões do cérebro para alcançar suas áreas-alvo. Quando os axônios invadem seus tecidos-alvo, eles estabelecem conexões sinápticas com neurônios-alvo pós-sinápticos. Em muitos tipos de neurônios, os axônios aumentam o número e a extensão espacial das conexões sinápticas que eles podem fazer elaborando redes de ramos terminais ou mandris¹. A projeção retino-tectal de girinos da rã aquática Xenopus laevis é um poderoso modelo de vertebrados para o exame de mecanismos subjacentes à arborização do AXON terminal e à conectividade sináptica^2,3,4 . O GFP individual que expressa mandris axonal óticos com sinalização molecular normal e alterada pode ser observado diretamente em girinos intactos, vivos de Xenopus ^5,6,7,8. Para expressar a GFP isoladamente ou em conjunto com versões completas ou truncadas de genes em pequeno número de neurônios ópticos, utilizamos uma técnica envolvendo microinjeção/lipofection de DNA em oculares de embriões de um dia de idade Xenopus ^9, a técnica ¹⁰. this foi desenvolvida originalmente para estudar mecanismos do pathfinding ótico do AXON em Tadpoles novos de Xenopus , e tem sido aplicada desde que nós e outro para determinar os mecanismos moleculars pilha-autônomos que subjacentes o AXON ótico arborização em Xenopus girinos^5,6,7,8,9,10.

Técnicas alternativas para expressar genes exógenos em um pequeno número de neurônios ópticos foram desenvolvidas em outras espécies-modelo, bem como em X. laevis. No entanto, cada uma dessas abordagens apresenta desafios e limitações quando comparada à microinjeção de DNA/reagente de lipofection em olhos de embriões Xenopus . Em camundongos, a transgênese pode ser usada para expressar genes em um pequeno número de neurônios ópticos, mas a geração de camundongos transgênicos é dispendiosa e os camundongos transgênicos e demorados frequentemente apresentam efeitos colaterais indesejáveis¹¹. O zebrafish transgenic que expressa genes exógenos em neurônios óticos pode igualmente ser criado injetando plasmídeos em embriões adiantados¹²da fase da segmentação. No entanto, este processo requer a clonagem de um promotor específico para expressar genes em um padrão de mosaico em neurônios ópticos em larvas de zebrafish¹². A frequência de expressão de DNA exógeno em neurônios ópticos em zebrafish transgênico também é um pouco menor (< 30%) comparado aos girinos Xenopus que foram microinjetados com reagente de DNA/Liposomal (30 − 60%)¹². No ovo o electroporation tem sido usado igualmente para expressar genes no pequeno número de neurônios óticos nos pintainhos¹³. Entretanto, este procedimento não caracterizou inteiramente os mecanismos que estabelecem projeções óticas porque o arborização ótico do AXON não pode ser imaged em embriões intactos, vivos do pintainho. Finalmente, vários laboratórios usaram eletroporação para transfecção genes em pequeno número de neurônios ópticos em Xenopus girinos^14,15. Ainda, o electroporation exige a optimização dos equipamentos e dos protocolos (stimulator, elétrodos, padrões espaciais e temporais de pulsos da onda) Além daquele usado para o microinjection do reagente do ADN/lipofection em ocular de embriões de Xenopus .

Nós e outros usamos previamente a técnica da microinjeção/lipofection do ADN em eyebuds de embriões do Xenopus para determinar os mecanismos autônomos da sinalização da pilha que estabelecem o arborização ótico^5,6 do AXON ⁷ anos de ^{, 8. inicialmente}utilizamos esta abordagem para dissecar as funções da proteína do adaptador de caderina e WNT β-catenina na arborização axonal óptica em Xenopus girinos^5,6. Em um estudo, nós mostramos que a ligação β-catenina à α-catenina e ao PDZ é necessária, respectivamente, para iniciar e moldar os mandris axonais ópticos in vivo⁵. Em um segundo relato, demonstramos que os domínios de ligação β-catenina para α-catenina e GSK-3β modulam de forma oposta os padrões de projeção dos mandris axonais ópticos ventrais⁶. Mais recentemente, identificamos papéis para o fator WNT, polipose adenomatosa coli (APC), na regulação das características morfológicas de mandris axonais ópticos em Xenopus girinos⁷. Ao coexpressar o N-terminal e os domínios centrais da APC que modulam a estabilidade da β-catenina e a organização dos microtúnios em conjunto com a GFP em neurônios ópticos individuais, determinamos papéis compartilhados e distintos para esses domínios de interação APC no número de filiais, comprimento e ângulo em mandris axonais ópticos in vivo⁷. Outro laboratório utilizou a técnica de microinjeção/lipofecção para determinar papéis autônomos de células para sinalização pelo receptor BDNF, TrkB, em mandris axonais ópticos em Xenopus girinos⁸. Este grupo mostrou que a expressão de um TrkB dominante-negativo perturbou a ramificação e a maturação sináptica em mandris óticos individuais do AXON in vivo⁸. Globalmente, a técnica de lipofecção no Xenopus já iluminou os papéis específicos de diferentes genes na ramificação do axão óptico no ambiente nativo.