الحقن المجهري للحمض النووي في براعم العيون في أجنة Xenopus laevis والتصوير من GFP التعبير عن الأشجار Axonal البصرية في سليمة، وحيا Xenopus Tadpoles
Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى توضيح كيفية حقن خليط الحمض النووي/DOTAP بالميكروين في عيون الأجنة القديمة من Xenopus laevis في يوم من الأيام، وكيفية تصوير وإعادة بناء البروتين الفلورسنت الأخضر الفردي (GFP) الذي يعبر عن الأربور اللافسونية البصرية في العقول المتوسطة التكتال سليمة ، والذين يعيشون Xenopus الضفادع.
Abstract
الإسقاط البصري الأساسي من الضفادع المائية Xenopus laevis بمثابة نظام نموذج ممتاز لدراسة الآليات التي تنظم تطوير الاتصال العصبية. أثناء إنشاء الإسقاط الريتينو تيكتال، تمتد المحاور البصرية من العين وتنتقل عبر مناطق متميزة من الدماغ للوصول إلى الأنسجة المستهدفة، وtectum البصرية. مرة واحدة axons البصرية تدخل tectum، فإنها تضع الأشجار الطرفية التي تعمل على زيادة عدد الاتصالات متشابك أنها يمكن أن تجعل مع الخلايا العصبية المستهدفة في tectum. هنا، ونحن نصف طريقة للتعبير عن الحمض النووي ترميز البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)، واكتساب وفقدان وظيفة الجينات المنشآت، في الخلايا العصبية البصرية (خلايا العقدة الشبكية) في أجنة Xenopus. نحن نشرح كيفية حقن الحمض النووي مجتمعة / lipofection الكاشف في براعم العين من الأجنة القديمة يوم واحد مثل أن يتم التعبير عن الجينات الخارجية في عدد واحد أو صغير من الخلايا العصبية البصرية. عن طريق وضع علامات على الجينات مع GFP أو الحقن المشترك مع بلازميد GFP، يمكن تصوير الأشجار axonal الطرفية من الخلايا العصبية البصرية الفردية مع الإشارات الجزيئية المتغيرة مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تكون صورة مباشرة في العقول يمكن قياسها كمياً. يسمح هذا البروتوكول بتحديد الآليات الجزيئية المستقلة للخلايا التي تكمن وراء تطوير مشتل أكسون بصري في الجسم الحي.
Introduction
أثناء تطور الجهاز العصبي، تتنقل محاور الخلايا العصبية المتبصرة عبر مناطق مختلفة من الدماغ للوصول إلى المناطق المستهدفة. عندما تغزو المحاور الأنسجة المستهدفة، فإنها تنشئ اتصالات متشابكة مع الخلايا العصبية المستهدفة postsynaptic. في العديد من أنواع الخلايا العصبية، والمحاور زيادة عدد والمدى المكاني للاتصالات متشابك أنها يمكن أن تجعل من خلال وضع شبكات من فروع المحطة الطرفية أو الأشجار1. الإسقاط الريتينو تيكتال من الضفادع المائية Xenopus laevis هو نموذج الفقاريات قوية لفحص الآليات الكامنة وراء مشتل محور أكسون المحطة الطرفية والاتصال متشابك2،3،4 . يمكن ملاحظة GFP الفردية التي تعبر عن الأشجار axonal البصرية مع الإشارات الجزيئية العادية والمتغيرة مباشرة في سليمة، وحيا Xenopus الضفادع 5،6،7،8. للتعبير عن GFP وحدها أو جنبا إلى جنب مع كامل طول أو الإصدارات المقتطعة من الجينات في عدد قليل من الخلايا العصبية البصرية، ونحن نستخدم تقنية تنطوي على الحقن المجهري / lipofection من الحمض النووي في براعم العين من يوم واحد القديمة Xenopus الأجنة9، 10.وقد وضعت هذه التقنية في الأصل لدراسة آليات pathfinding axon البصرية في الضفادع Xenopus الشباب، ومنذ ذلك الحين تم تطبيقها من قبلنا والآخرين لتحديد الخلايا المستقلة الآليات الجزيئية الكامنة وراء axon البصرية التشتل في Xenopus الضفادع5،6،7،8،9،10.
وقد وضعت تقنيات بديلة للتعبير عن الجينات الخارجية في عدد قليل من الخلايا العصبية البصرية في الأنواع النموذجية الأخرى، وكذلك في X. laevis. ومع ذلك، فإن كل من هذه النهج يطرح تحديات وقيود بالمقارنة مع الحقن المجهري للحمض النووي/الكاشف في براعم العين من أجنة Xenopus. في الفئران، يمكن استخدام الجينات للتعبير عن الجينات في عدد صغير من الخلايا العصبية البصرية، ولكن توليد الفئران المعدلة وراثيا مكلفة وتستغرق وقتا طويلا والفئران المعدلة وراثيا غالبا ما تكون موجودة مع الآثار الجانبية غير المرغوب فيها11. كما يمكن إنشاء أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا التي تعبر عن الجينات الخارجية في الخلايا العصبية البصرية عن طريق حقن بلازميدات في الأجنة مرحلة الانقسام في وقت مبكر12. ومع ذلك، تتطلب هذه العملية استنساخ المروج محددة للتعبير عن الجينات في نمط الفسيفساء في الخلايا العصبية البصرية في يرقات حمار وحشي12. كما أن تواتر التعبير عن الحمض النووي الخارجي في الخلايا العصبية البصرية في أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثياً أقل إلى حد ما (<30%) بالمقارنة مع ضفادع Xenopus التي تم حقنها بالحمض النووي/ الكاشف الليبوسومي (30−60%)12 . في ovo الكهروبورة كما استخدمت للتعبير عن الجينات في أعداد صغيرة من الخلايا العصبية البصرية في الفراخ13. ومع ذلك، فشل هذا الإجراء في توصيف كامل الآليات التي تضع الإسقاطات البصرية لأن مشتل أكسون بصري لا يمكن أن يصور في الأجنة الفرخ الحية سليمة. وأخيرا، استخدمت عدة مختبرات الكهربائي لنقل الجينات إلى عدد صغير من الخلايا العصبية البصرية في الضفادع Xenopus 14،15. ومع ذلك، يتطلب الكهربة الاستفادة المثلى من المعدات والبروتوكولات (محفز، والأقطاب الكهربائية، والأنماط المكانية والزمنية لنبضات الأمواج) بما يتجاوز تلك المستخدمة للحقن المجهري لكاشف الحمض النووي/lipofection في براعم العيون لأجنة Xenopus.
نحن وآخرون استخدمنا سابقا تقنية الحقن المجهري / lipofection من الحمض النووي في براعم العين من أجنة Xenopus لتحديد الخلايا المستقلة آليات الإشارات التي تنشئ مشتل axonالبصرية 5،6، 7 , 8.استخدمنا في البداية هذا النهج لتشريح وظائف الكادرين وWnt محول البروتين β-catenin في مشتل axonal البصرية في xenopus الضفادع5،6. في دراسة واحدة، أظهرنا أن بيتا-الكاتينين ملزمة لα-catenin وPDZ مطلوب، على التوالي، لبدء وتشكيل الأشجار axonal البصرية في الجسم الحي5. في تقرير ثان، أظهرنا أن المجالات الملزمة بيتا-الكاتينين لα-catenin و GSK-3β عكس أنماط الإسقاط تحوير من الأشجار الأنبية البطينيةaxonal 6. في الآونة الأخيرة، حددنا الأدوار لعامل Wnt، الورم الحميد بوليبوسيس القولونية (APC)، في تنظيم السمات المورفولوجية من الأشجار السمعية في Xenopus الضفادع7. من خلال المشاركة في التعبير عن N-الطرفية والمجالات المركزية من APC أن تعدل بيتا-catenin الاستقرار وتنظيم microtubule جنبا إلى جنب مع GFP في الخلايا العصبية البصرية الفردية، حددنا الأدوار المشتركة والمتميزة لهذه المجالات التفاعل APC على رقم الفرع، طول، وزاوية في الأشجار axonal البصرية في الجسم الحي7. واستخدم مختبر آخر تقنية الحقن المجهري/الشفة لتحديد الأدوار المستقلة للخلايا للإشارة بواسطة مستقبلات BDNF، TrkB، في أرل axonal البصرية في الضفادع Xenopus 8. وأظهرت هذه المجموعة أن التعبير عن TrkB المهيمنة السلبية المتفرعة المضطربة والنضج متشابك في الأشجار أكسون البصرية الفردية في الجسم الحي8. بشكل عام، فإن تقنية lipofection في Xenopus قد أضاءت بالفعل الأدوار المحددة للجينات المختلفة في المتفرعة من axon البصرية في البيئة الأصلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، نبين كيفية التعبير عن بنيات الحمض النووي الخارجية في أعداد واحدة أو صغيرة من الخلايا العصبية البصرية وكيفية صورة GFP الفردية التي تعبر عن الأشجار axonal البصرية مع الإشارات الجزيئية العادية والمتغيرة في سليمة، وأعمدة المعيشة من الضفدع X . محمد محمد كما نشرح كيفية إعادة بن?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جامعة تورو كلية كاليفورنيا للطب العظام لدعم أبحاثنا. ونحن نعترف الطلاب السابقين في المختبر (إستر وو، غريغوري بنغ، تايغون جين، جون ليم) الذين ساعدوا في تنفيذ هذه التقنية الحقن المجهري في مختبرنا. ونحن ممتنون للدكتورة كريستين هولت، التي تم تطوير تقنية الحقن المجهري/الشفة في أجنة Xenopus لأول مرة في مختبرها.
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
Referencias
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
