JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Quimica

Ионная мобильность-массовая спектрометрия Методы для определения структуры и механизмов распознавания ионов металла и Redox деятельности металлических связывая олигопептиды

Published: September 07, 2019
doi:
10.3791/60102
, , , ,
1Department of Chemistry,Texas A&M University-Commerce

Summary

Ионно-массовая спектрометрия и методы молекулярного моделирования могут характеризовать селективное металлическое хелативирование производительности разработанных металлосвязывающих пептидов и медно-связывающего пептида метанобактина. Разработка новых классов металлических хелатных пептидов поможет привести к терапии заболеваний, связанных с дисбалансом ионов металла.

Abstract

Ионизация электроспрея (ESI) может передавать пептидный или пептидный комплекс в газофазный комплекс, сохраняя при этом его массу, общий заряд, металлосвязывающие взаимодействия и конформационную форму. Соединение ESI с ионной массой-спектрометрией (IM-MS) обеспечивает инструментальную технику, которая позволяет одновременно измерять массу пептида к заряду (м/з) и сечение столкновения (CCS), которые относятся к его стойхиометрии, состоянию протонации, и конформационная форма. Общий заряд пептидного комплекса контролируется протонацией 1) кислой пептидной и основных участков пептида и 2) состояния окисления металлического иона (ы). Таким образом, общее состояние заряда комплекса является функцией рН раствора, который влияет на пептиды металлических ионных связывающих сродства. Для анализа ESI-IM-MS решения пептида и ионов металла готовятся из растворов только для водных, при этом рН регулируется с разбавленной aqueous уксусной кислотой или гидроксидом аммония. Это позволяет определить зависимость от рН и селективность ионов металла для конкретного пептида. Кроме того, м/з и CCS пептидного комплекса могут быть использованы с помощью молекулярного моделирования B3LYP/LanL2D, чтобы различить связывающие участки координации иона металла и третичной структуры комплекса. Результаты показывают, как ESI-IM-MS может охарактеризовать селективное хелатирование работы набора альтернативных пептидов метанобактина и сравнить их с медно-связывающим пептидным метанобактином.

Introduction

Ионы меди и цинка имеют важное значение для живых организмов и имеют решающее значение для процессов, включая окислительную защиту, рост тканей, дыхание, холестерин, метаболизм глюкозы и чтение генома1. Для обеспечения этих функций, такие группы, как тиолат Cys, имидазол его2,3, (более редко) тиоэтер метионина, и карбоксилат глю и Асп выборочно включать металлы в качестве кофакторов в активных местах металлургии. Сходство этих координационных групп поднимает интригующий вопрос о том, как Его и Кис лиганды выборочно включать либо Cu (I/II) или N (II) для обеспечения правильного функционирования.

Селективная привязка часто достигается путем приобретения и оборота пептидов, которые контролируют концентрации ионов Cu (I/II)4. Cu(I/II) является высокореактивной и вызывает окислительный ущерб или приключений связывания с ферментами, так что его свободная концентрация жестко регулируется медных сопровождающих и медно-регулирующих белков, которые транспортируют его безопасно в различные места в клетке и плотно контролировать свой гомеостаз5,6. Нарушение метаболизма меди или гомеостаза непосредственно связано с болезнью Менкеса и Уилсона7, а также рак7 и нервные расстройства, такие как прион8 и болезнь Альцгеймера9.

Болезнь Уилсона связана с повышением уровня меди в глазах, печени и участках мозга, где редокс-реакции Cu (I/II) производят реактивные виды кислорода, вызывая гепатомлентику и неврологическую дегенерацию. Существующие хелатотерапии являются небольшой тиол аминокислоты пеницилламин и триэтиленетрамин. Кроме того, метанотрофных медь приобретения пептиды метанобатактина (мб)10,11 экспонат терапевтический потенциал из-за их высокой связывающей сродство cu (I)12. Когда метанобактин (mb-OB3b) из трихоспория Methylosinus OB3b был изучен в животной модели болезни Вильсона, медь была эффективно удалена из печени и выводится через желчь13. Эксперименты in vitro подтвердили, что mb-OB3b может хеляции меди из медного металлотионеина, содержащегося в цитозоле печени13. Лазерная абляция индуктивно связаны плазменной массой спектрометрии визуализации методы исследовали пространственное распределение меди в болезни Вильсона образцы печени14,15,16 и показали, что mb-OB3b удаляет медь с короткими периодами лечения только 8 дней17.

MB-OB3b также будет связываться с другими ионами металла, включая Ag (I), Au(III), Pb (II), Mn (II), Co (II), Fe (II), Ni (II), и Зн(II)18,19. Конкуренция за физиологические Cu (I) связывания сайт выставлен ag (I), потому что он может вытеснить Cu (I) из комплекса MB-OB3b, как с Ag (I) и Ni (II) также показывает необратимые связывания мб, которые не могут быть смещены Cu (I)19. В последнее время серия альтернативных метаноактина (амб) олигопептиды с 2His-2Cys связывающий мотив были изучены20,21, и их N (II) и Cu (I/II) связывающие свойства характеризуется. Их первичные аминокислотные последовательности похожи, и все они содержат мотив 2His-2Cys, Pro и ацетилированный N-терминус. Они в основном отличаются от mb-OB3b, потому что мотив 2His-2Cys заменяет два энетиола оксазолон связывания сайтов mb-OB3b.

Ионизация электроспрея в сочетании с ионно-массовой спектрометрией (ESI-IM-MS) обеспечивает мощную инструментальную технику для определения металлосвязывающих свойств пептидов, поскольку она измеряет их массу к заряду(м/з)и столкновение поперечное сечение (CCS) при сохранении их массы, заряда и конформационной формы от фазы решения. М/з и CCS относятся к пептидам стоихиометрии, состоянию протонации и конформации. Stoichiometry определяется потому, что личность и количество каждого элемента, присутствуют в видов явно определены. Общий заряд пептидного комплекса связан с состоянием протонации кислых и основных участков и состоянием окисления металлического иона (ы). CCS дает информацию о конформиционной форме пептидного комплекса, поскольку она измеряет вращенный средний размер, который относится к третичной структуре комплекса. Общее состояние заряда комплекса также является функцией рН и влияет на металлическую ионную сродство пептида, потому что депротонированные основные или кислые участки, такие как карбоксил, его, Cys и Tyr, также являются потенциальными местами связывания металлического иона. Для анализа пептид и ион металла готовятся в водных растворах с рН, скорректированным разбавленной aqueous уксусной кислотой или гидроксидом аммония. Это позволяет определить зависимость от рН и селективность ионов металла для пептида. Кроме того, м/з и CCS, определенные ESI-IM-MS, могут быть использованы с помощью молекулярного моделирования B3LYP/LanL2D, чтобы обнаружить тип координации ионов металла и третичной структуры комплекса. Результаты, приведенные в этой статье, показывают, как ESI-IM-MS может охарактеризовать селективную хелатную производительность набора пептидов amb и сравнить их с медно-связывающим пептидом mb-OB3b.

Protocol

1. Подготовка реагентов Культура Метилосинус трихоспорий OB3b, изолировать Cu (I) бесплатно mb-OB3b18,22,23, заморозить сухой образец и хранить при -80 градусов по Цельсию до использования. Синтезировать амб пептиды (ямт;98% чистоты д?…

Representative Results

Металлический переплетамб1IM-MS исследование20 из amb1 (Рисунок 1A) показали, что как медь и цинк ионов связаны с amb1 в рН-зависимым образом (Рисунок 2). Тем не менее, медь и цинк связаны с amb1 через различные …

Discussion

Критические шаги: сохранение поведения на фазе решения для обследования через ESI-IM-MS
Родные инструментальные настройки ESI должны быть использованы, которые сохраняют пептид ытоихиометрии, состояние заряда и конформационную структуру. Для местных условий необходимо оптимиз?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот материал основан на работе, поддерживаемой Национальным научным фондом в соответствии с 1764436, поддержкой инструментов NSF (MRI-0821247), Фондом Уэлча (T-0014) и вычислительными ресурсами Министерства энергетики (TX-W-20090427-0004-50) и L3 Communications . Мы благодарим группу Бауэра Калифорнийского университета – Санта-Барбара за то, что они поделились программой Sigma и Айобами Илесанми за демонстрацию техники в видео.

Materials

acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole – ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114 (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256 (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, &. #. 1. 9. 3. ;. Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107 (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116, 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30 (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256 (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305 (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80 (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7 (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25 (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson’s disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson’s disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson’s disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19 (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility – mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51 (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261 (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14 (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141 (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84 (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98 (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 284-298 (1985).
  35. . Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. , (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8 (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50 (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88 (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18 (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. , (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4 (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5 (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43 (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96 (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17 (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50 (4), 1378-1391 (2011).

Tags

Ion Mobility-mass SpectrometryIM-MSMetal Ion RecognitionRedox ActivityMetal Binding OligopeptidesMolecular ModelingTertiary StructureMetal CorrelationESI-IM-MSPoly-DL-alanineAlternative MethanobactinPH-dependent RedoxMethyl Binding ReactionProduct IonsStoichiometryProtonation StateConformational StructureMetal Chelating PeptidesTherapeuticsMenkes DiseaseWilson’s DiseaseCancerAlzheimer’s DiseaseNative ESI-IM-MSNegative IonPositive IonAcetic AcidAmmonium HydroxideMass-to-chargeIsotope Pattern

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image