Profilage du complexome haute résolution par cryoslicing BN-MS Analysis

La grande majorité des études conventionnelles de BN-MS ainsi que l’approche csBN-MS à haute résolution récemment établie ont été appliquées aux préparations mitochondriales et plastides qui sont (i) facilement disponibles, (ii) ont une complexité limitée, et (iii) expriment complexes protéiques cibles (membranes) à forte densité. Ce protocole étend l’application du profilage du complexome à haute résolution aux membranes non mitochondriales exprimant des protéines peu abondantes, sur lesquelles peu d’informations sur leur intégration dans les complexes sont disponibles. À des fins de démonstration, nous avons choisi une préparation de membrane endosome-enrichie du rein de souris obtenu par centrifugation de gradient de densité. L’optimisation de cette préparation a été guidée par la protéine marqueur TPC1 qui forme des canaux ioniques intracellulaires principalement localisés aux endosomes précoces et de recyclage12. Il est également fortement exprimé dans les cellules tubulaires proximales rénales, comme le montre l’analyse immunohistochimique des sections de tissu rénal (Figure 1A). Ces membranes ont été doucement solubilisées (ComplexioLyte 47 à un faible rapport protéine/détergent de 1:8) et concentrées sur un coussin de saccharose par ultracentrifugation. Cette dernière s’est avérée être une étape importante pour éliminer l’excès de composants de poids moléculaire inférieur (c.-à-d. détergents, lipides, sels, polymères organiques et métabolites) qui ont tendance à avoir un impact négatif sur la résolution des séparations préparatives de BN-PAGE. La séparation complexe sur un gel de gradient polyacrylamide natif de 1 % à 13 %(w/v) (figure 1B, panneau moyen) a montré des bandes protéiques fortement tachées avec très peu d’artefacts de migration. La séparation SDS-PAGE d’une bande étroite de gel BN-PAGE(figure 1B, cadre en boîte en rouge) comme deuxième dimension suivie d’une analyse de tache occidentale a montré un modèle bien résolu de populations complexes distinctes associées au TPC1(figure 1B , panneau supérieur, marqué par des flèches rouges), probablement résultant de l’association avec des sous-unités protéiques supplémentaires et/ou des modifications post-traductionnelles (comme la glycosylation12). Une section d’intérêt de 3 cm a été excisée, fixe et traitée pour le découpage de cryomicrotome tel que décrit11. Les étapes individuelles de cette procédure (en particulier, l’alignement précis de la section de gel large), qui est d’une importance critique pour préserver la résolution lors de l’échantillonnage, sont documentées dans la vidéo d’accompagnement. La section de gel incorporée a finalement été découpée en 101 tranches de gel d’une épaisseur uniforme de 0,25 mm(figure 1B, panneau inférieur), qui ont été digérées séparément et analysées par une spectrométrie de masse couplée l.C.LC haute performance. En plus de la résolution de taille, la qualité de la quantification de protéine est la clef pour le profilage réussi de complexome. Avec la configuration et les paramètres de SP utilisés, l’analyse des échantillons a été assez complète, ce qui a permis d’identifier en moyenne plus de 1 000 protéines et 10 000 peptides (dont 8 200 protéinés) par tranche, et environ 3 000 protéines et 43 000 peptides (38 500 d’entre eux étaient protéiques) au total. Néanmoins, en raison de la nature stochastique du séquençage MS/MS dépendant des données et de ses limites dans l’aire de répartition dynamique, l’information sur l’intensité était encore fragmentaire pour les protéines moins abondantes. Par conséquent, une procédure de traitement des données de la SP11a été effectuée qui est basée sur l’attribution précise des signaux peptidiques (volumes de pointe [PV] – intensités de signaux liées au peptide intégrées sur m/z et temps) sur toute la série de jeux de données. Comme le montre la figure 2A,B, les écarts des signaux peptidiques dans le temps de conservation et de masse qui sont restés après l’étalonnage étaient identiques pour les PV assignés à la SP et pour les PV assignés indirectement (avec des tolérances très étroites de ‘lt;1 ppm et ‘lt;0.5 min pour 95% de les PV), indicatif d’un taux très bas pour l’affectation PV faussement positive. Les valeurs aberrantes restantes ont été filtrées en fonction de leur cohérence avec d’autres PV connexes. Étant donné que toutes les mesures de La MS ont été effectuées consécutivement sur la même configuration LC-MS sans modification des paramètres ou des composants matériels, les variations de run-to-run (déterminées comme médiane de toutes les intensités PV dans un échantillon par rapport à celles des tranches voisines) ont été petites et facilement éliminées par la mise à l’échelle des jeux de données PV (figure 2C). L’information d’intensité peptide résultante a ensuite été employée pour reconstruire 2.545 profils relatifs d’abondance de protéine. Comme le montre la figure 2D, plus de 75 % de ces profils protéiques étaient basés sur au moins trois peptides indépendants spécifiques aux protéines. Ensuite, le protocole a évalué la pertinence de la taille progressive de l’échantillonnage du gel BN-PAGE pour la résolution des complexes protéiques. À cette fin, les ensembles de données de tranches ont été rejoints en résumant les informations PV de deux, trois ou quatre tranches consécutives, simulant ainsi le résultat pour des tailles d’étape de 0,5 mm, 0,75 mm et 1 mm (par rapport à l’échantillonnage initial de 0,25 mm). La figure 3 illustre les profils d’abondance résultants pour la protéine TPC1 à titre d’exemple (A-D). À 0,25 mm, les intensités relatives et la séparation de la taille des populations complexes associées au TPC1(figure 3A) étaient bien en accord avec les résultats de l’analyse de la tache occidentale(figure 1B, panneau supérieur); bien que, le profil a montré un certain bruit, la plupart du temps résultant de valeurs manquantes (“lacunes”) dans la matrice PV utilisée pour la quantification. L’assemblage de deux tranches correspondant à 0,5 mm a maintenu les intensités et la séparation correctes des complexes associés à TPC1 et a enlevé le bruit de la quantité(figure 3B). En revanche, des pas plus grands de 0,75 mm et 1 mm (figure 3C,D) ont entraîné une perte de résolution de la taille et aboli la discrimination des sous-populations complexes de TPC1. Il convient de noter que la grande majorité des analyses conventionnelles publiées BN-MS utilisent des tranches de 2 mm coupées manuellement (environ 60 pour couvrir l’ensemble de la voie de gel)7,8,9,10. La conversion de la distance de migration ou de l’indice de tranche en taille moléculaire est généralement basée sur des marqueurs, soit des protéines standard indigènes disponibles dans le commerce, soit des complexes protéiques endogènes bien caractérisés avec une composition sous-unité connue (principalement [super] complexes de la chaîne respiratoire oxydative mitochondriale [OXPHOS])13. Cependant, puisque la séparation BN-PAGE est basée sur la section moléculaire efficace qui est déterminée non seulement par la masse moléculaire mais aussi par la structure 3D et le nombre de lipides, de détergents et de molécules de Coomassie associés, les protéines individuelles peuvent montrer déviations plus importantes. Par conséquent, il a été choisi d’utiliser de plus grands ensembles de complexes protéiques comme marqueurs11. L’intrigue de la figure 4 montre 23 marqueurs sélectionnés avec une sous-unité représentative montrée sous forme de cercle noir, indiquant les valeurs log10 de sa masse moléculaire prévue (selon la base de données UniProtKB/Swiss-Prot) vs. l’indice de tranche du maximum de pic de profil correspondant. Ces derniers ont été obtenus à partir d’ajustements gaussiens automatisés aux données d’abondance relative, comme le montre l’en-tête de la figure 4 montrant l’exemple avec le chaperon BCS1. La régression linéaire (ligne rouge) a fourni une fonction pour convertir les valeurs d’index de tranche en tailles moléculaires apparentes, qui se sont étendues de 160-630 kDa, le long de la section étudiée de gel. Enfin, l’analyse a fourni de l’information sur des complexes bien caractérisés et a démontré l’existence de nouvelles sous-unités et d’assemblages complexes. Des exemples mettant en évidence différents aspects du complexe sont présentés à la figure 5 (A-C : protéines exprimées ou de préférence situées dans des compartiments endosomal; D-F : complexes d’autres localisations subcellulaires). La ferritine de transport de fer est connue pour former des complexes à partir de 24 sous-unités légères (FRIL1) et/ou lourdes (FRIH), avec un poids moléculaire total de 440 kDa14 (figure 5A, flèche remplie). Les profils de sous-unité (figure 5A) suggèrent l’existence d’au moins deux formes plus petites du complexe (avec une masse apparente de 360 kDa et 340 kDa; flèches ouvertes) avec des stoichiométries distinctes à chaîne lourde/légère (mieux visibles après la mise à l’échelle de abondantes, enset de la figure 5A) qui sont abondamment présents dans les endosomes. En revanche, les complexes nicalin-nomo115 (figure 5D), le complexe de noyau gamma-sécrétase16 (figure 5B), et la machinerie GPI-transamidase17 (figure 5E) montrent les rapports d’abondance de leurs sous-unités de noyau sur toute la gamme de taille et indépendants de l’association avec des protéines additionnelles. Cela indique que leurs sous-unités sont exclusives les unes aux autres. Les vacuolar H-ATPasessont des complexes multiprotéinés assemblés à partir d’un pool de plus de 20 sous-unités de manière modulaire d’un poids moléculaire total d’environ 900 kDa. La figure 5C révèle des sous-complexes dont les compositions distinctes proviennent d’au moins 17 sous-unités, représentant des intermédiaires biologiques ou des sous-complexes générés par les conditions expérimentales, dont certains ont également été observée dans une étude récente du BN-MS18. Un autre exemple complexe multi-protéines est le protéasome19 (Figure 5F). L’inspection minutieuse des profils d’abondance des sous-unités alpha et bêta formant le noyau protéasome 20S suggère deux populations complexes majeures avec des différences subtiles de taille (590 kDa et 575 kDa, indiquées par des flèches grises) et l’intégration de trois bêta-unités. En résumé, le profilage complexe csBN-MS des membranes rénales enrichies d’endosome fournit des résultats complets et détaillés concernant l’intégration (i) de protéines cibles uniformes et peu abondantes dans des complexes, (ii) la composition générale des sous-unit complexes et stoichiométrie, et (iii) hétérogénéités complexes, sous-structures, et (dis)assemblage intermédiaires. Figure 1 : Séparation préparative de BN-PAGE des membranes endosome-enrichies solubilized du rein de souris utilisant le canal intracellulaire TPC1 comme marqueur. (A) Localisation immunohistochimique de la protéine TPC1 dans les tubules proximales rénaux par microscopie confocale. Vert : anticorps anti-TPC112 colorations visualisées avec l’IgG anti-lapin de chèvre cy3-biotinylated secondaire ; rouge : lectine de tétragonolobus de Lotus biotinylated (LTL, 10 g/mL, FITC-conjugué) marquant la surface luminale des cellules tubuleuses proximales. L’enset montre la coloration d’une section correspondante d’un rein TPC1-KO comme un contrôle négatif. Les barres d’échelle blanche sont de 20 m. A noter également une forte expression TPC1 dans les vésicules intracellulaires, connu à partir d’expériences indépendantes pour représenter les endosomes précoces et de recyclage12. (B) Séparation préparative BN-PAGE de 2,5 mg de membranes enrichies d’endosome solubilized sur un gel de gradient de polyacrylamide de 1%-13% (w/v). Une voie étroite (encadrée en rouge) a été coupée pour l’analyse ultérieure de sDS-PAGE/western blot (panneau supérieur), résolvant différents complexes tPC1-associés et modèles de glycosylation (flèches rouges : anti-TPC1/anti-lapin HRP/ECL; vert : positions et modèles prévus masses [MDa] des complexes protéiques marqueurs identifiés par la coloration totale des protéines [tache de tache de rubis SYPRO]) de la tache. De droite à gauche : Na/K-transportATPase, Dimer complexe Cytochrome b-c1, synthase ATP, NADH:ubiquinone oxidoreductase. Une section d’intérêt de 3 cm de la voie de gel a été excisée, incorporée dans le milieu d’intégration de tissu, montée, et découpée en 101 sections (0.25 mm) le long du front de migration de protéine utilisant un cryomicrotome (panneau inférieur ; voir lien vidéo). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Paramètres clés déterminant l’exactitude de l’affectation et de la quantification du signal de SP ainsi que la profondeur de l’analyse. (A) Répartition des erreurs de masse relative (en ppm) après l’étalonnage m/z de La SP/MS séquencées (barres rouges) et indirectement assignées (c.-à-d. en fonction des temps de masse et de rétention étroitement appariés, voir protocole; barres bleues) signaux peptidiques. Cela suggère une erreur de masse finale de 1 ppm (pour 95 % des signaux/PV assignés) et un taux très faible de fausses affectations positives. (B) Répartition des écarts de temps de rétention nano-HPLC par rapport à la moyenne totale après l’alignement du temps d’élution des signaux peptidiques, à l’aide de la régression de Loess (voir protocole) et du codage des couleurs tel qu’il est utilisé dans (A). L’erreur de temps est inférieure à 30 s pour les signaux peptidiques/PVs assignés. (C) Variation run-to-run des intensités totales de SP tracées par rapport à la moyenne des deux échantillons voisins. Ces facteurs d’échelle ont été appliqués aux tables PV brutes pour minimiser les erreurs techniques systématiques. (D) Informations peptides utilisées pour calculer les profils d’abondance relative des protéines. Après avoir filtré des peptides spécifiques aux protéines pour les valeurs aberrantes, les identifications ponctuelles ou uniques (voir protocole), 2 545 profils d’abondance de protéines ont été déterminés, dont 75 % étaient basés sur au moins trois peptides en toute confiance raisonnable. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Impact critique de la taille de l’étape dans l’échantillonnage du gel sur la résolution du complexome de TPC1. Les ensembles de données ont été rejoints en résumant les intensités de signal dans les groupes de 1, 2, 3 et 4 tranches consécutives (A-D, respectivement) et traités de façon identique pour simuler différentes tailles d’étapes dans le découpage de gel comme indiqué. Le profil TPC1 montre un certain bruit (suréchantillonnage) à 0,25 mm, mais une bonne résolution de taille de trois populations complexes (voir aussi Figure 1B), qui est en grande partie préservée à une largeur d’étape de 0,5 mm. La discrimination de ces populations se perd à mesure que 1 mm est approché. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Détermination du poids moléculaire apparent. 23 complexes de marqueurs avec composition moléculaire définie (tel qu’indiqué, selon UniProtKB/Swiss-Prot) ont été utilisés comme marqueurs de taille. Les valeurs logarithmiques de leur poids moléculaire prévu (en kDa) ont été tracées vs. l’indice de tranche maximale de pic de profil de la sous-unité de protéine représentative indiquée (cercles remplis en noir). L’ajustement linéaire de régression à cette donnée (ligne rouge) a fourni une fonction convertissant des valeurs d’index de tranche aux poids moléculaires apparents. Les maxima de crête ont été déterminés par des ajustements gaussiens automatisés aux pics de profil de protéine comme indiqué dans l’enset (droite) pour la protéine de chaperon BCS1 (données primaires en bleu, limites d’ajustement indiquées par les lignes oranges, fonction d’ajustement en rouge). En outre, ces ajustements détermines pic demi-maximum largeurs (ligne verte, 6,5 tranches, ou 1,6 mm pour l’exemple montré) avec les complexes de mise au point les plus pointus couvrant autour d’un gel de 1,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Exemples de profils de sous-unité complexes protéiques. Abondance relative de protéines vs. poids moléculaire apparent tracé pour la chaîne lourde et légère de la ferritine (A) révélant l’hétérogénéité moléculaire de la stoichiométrie subunit de ferritine, plus clairement visible après la redimensionnement des abondances (enset). Les flèches remplies et les flèches ouvertes désignent le complexe complet (440 kDa) et deux sous-complexes, respectivement. Les sous-unités gamma-sécrétase (B) se sont quantitativement intégrées dans une population complexe unifamiliale. Les sous-complexes de vacuolar H-ATPases(C) présentaient de multiples assemblages avec une composition sous-unité distincte, tous exprimés en endosomes. Les protéines nomo1 et nicalin (D) ont formé un complexe exclusif (le GPI-transamidase), qui est une machinerie enzymatique multi-subunit formant plusieurs complexes. (E) Le complexe de noyau protéasome 20S montrant (F) un modèle subtil de sous-complexe avec deux populations indiquées par des flèches en gris, toutes provenant d’autres localisations subcellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.