Hybride Microdrive systeem met herstelbaar opto-silicium sonde en Tetrode voor Dual-site high density opname in vrij bewegende muizen
Summary
Dit protocol beschrijft de bouw van een hybride Microdrive-array waarmee implantatie van negen onafhankelijk instelbare tetrodes en één instelbare opto-silicium sonde in twee hersengebieden in vrij bewegende muizen mogelijk is. Ook gedemonstreerd is een methode voor het veilig herstellen en hergebruiken van de opto-silicium sonde voor meerdere doeleinden.
Abstract
Multi-regionale neurale registraties kunnen cruciale informatie bieden voor het begrijpen van de interacties tussen meerdere hersen regio’s met een fijne tijdschaal. Conventionele Microdrive-ontwerpen staan echter vaak slechts één type elektrode toe om te registreren vanuit één of meerdere regio’s, waardoor de opbrengst van enkelvoudige of diepte-profiel opnames wordt beperkt. Het beperkt ook vaak de mogelijkheid om elektrode opnames te combineren met optogenetische hulpmiddelen om het pad en/of celtype specifieke activiteit te targeten. Hier gepresenteerd is een hybride Microdrive array voor vrij bewegende muizen om de opbrengst te optimaliseren en een beschrijving van de fabricage en het hergebruik van de Microdrive-array. Het huidige ontwerp heeft negen tetrodes en één opto-silicium sonde in twee verschillende hersengebieden tegelijkertijd in vrij bewegende muizen. De tetrodes en de opto-silicium sonde zijn onafhankelijk instelbaar langs de dorsoventral as in de hersenen om de opbrengst van eenheid en oscillerende activiteiten te maximaliseren. Deze Microdrive-array bevat ook een set-up voor licht, bemiddelende optogenetische manipulatie om de regionale-of celtypespecifieke reacties en functies van neurale circuits met lange afstand te onderzoeken. Bovendien kan de opto-silicium sonde na elk experiment veilig worden teruggewonnen en hergebruikt. Omdat de Microdrive-array bestaat uit 3D-geprinte onderdelen, kan het ontwerp van micro drives eenvoudig worden aangepast voor verschillende instellingen. Eerst beschreven is het ontwerp van de Microdrive array en hoe de optische vezel te hechten aan een silicium sonde voor optogenetica experimenten, gevolgd door de fabricage van de Tetrode bundel en implantatie van de array in een muis brein. De opname van lokale veld potentialen en unit stekelige gecombineerd met optogenetische stimulatie tonen ook de haalbaarheid van de Microdrive array systeem in vrij bewegende muizen.
Introduction
Het is cruciaal om te begrijpen hoe Neuronale activiteit cognitief proces ondersteunt, zoals leren en geheugen, door te onderzoeken hoe verschillende hersengebieden dynamisch met elkaar omgaan. Om de dynamiek van de neurale activiteit onderliggende cognitieve taken te verhelderden, is grootschalige extracellulaire elektrofysiologie uitgevoerd in vrij bewegende dieren met behulp van Microdrive arrays1,2,3, 4. In de afgelopen twee decennia zijn verschillende soorten Microdrive-array ontwikkeld om elektroden in meerdere hersengebieden te implanteren voor ratten5,6,7,8 en muizen9, 10 , 11 , 12. niettemin, huidige Microdrive ontwerpen in het algemeen niet toestaan voor het gebruik van meerdere sonde types, dwingen onderzoekers om een enkele elektrode type met specifieke voordelen en beperkingen te kiezen. Tetrode arrays werken bijvoorbeeld goed voor dichtbevolkte hersengebieden zoals de dorsale Hippocampus Ca11,13, terwijl siliconen sondes een beter geometrisch profiel geven voor het bestuderen van anatomische verbindingen14 , 15.
Tetrodes en silicium sondes worden vaak gebruikt voor in vivo chronische opname, en elk heeft zijn eigen voor-en nadelen. Tetrodes hebben bewezen aanzienlijke voordelen te hebben in een betere isolatie van één eenheid dan enkelvoudige elektroden16,17, naast kosteneffectiviteit en mechanische stijfheid. Ze bieden ook hogere opbrengsten van activiteiten met één eenheid in combinatie met micro drives8,18,19,20. Het is essentieel om het aantal gelijktijdig opgenomen neuronen voor het begrijpen van de functie van neurale circuits21te verhogen. Er zijn bijvoorbeeld grote aantallen cellen nodig om kleine populaties van functioneel heterogene celtypen te onderzoeken, zoals tijdgerelateerde22 -of belonings codering23 -cellen. Er zijn veel hogere celaantallen nodig om de decoderings kwaliteit van Spike sequenties13,24,25te verbeteren.
Tetrodes hebben echter een nadeel bij het opnemen van ruimtelijk gedistribueerde cellen, zoals in de cortex of de thalamus. In tegenstelling tot tetrodes, silicium sondes kunnen ruimtelijke distributie en interactie van lokale veld potentialen (lfps) en stekelige activiteiten binnen een lokale structuur14,26bieden. Multi-schacht silicium sondes vergroten het aantal opnamelocaties verder en maken opname mogelijk in enkele of naburige structuren27. Echter, dergelijke arrays zijn minder flexibel in de positionering van elektrode-sites in vergelijking met tetrodes. Bovendien zijn complexe Spike-sorteer algoritmen vereist in hoge-dichtheids tests om informatie te extraheren over actiemogelijkheden van naburige kanalen om de gegevens te spiegelen die zijn verworven door tetrodes28,29,30. Vandaar dat de totale opbrengst van enkelvoudige eenheden vaak minder is dan tetrodes. Bovendien zijn silicium sondes nadelig vanwege hun broosheid en hoge kosten. Zo is de keuze van tetrodes vs. silicium sondes afhankelijk van het doel van de opname, wat een vraag is of het verkrijgen van een hoge opbrengst van enkelvoudige eenheden of ruimtelijke profilering op de opnamelocaties prioriteit krijgt.
Naast het opnemen van neurale activiteit, is optogenetische manipulatie uitgegroeid tot een van de krachtigere instrumenten in de neurowetenschappen om te onderzoeken hoe specifieke celtypen en/of trajecten bijdragen aan neurale circuit functies13,31, 32,33. Echter, optogenetische experimenten vereisen extra aandacht in Microdrive array ontwerp om de vezel connector te hechten aan stimulatie lichtbronnen34,35,36. Vaak is het aansluiten van Fiber-Optics een relatief grote kracht, wat kan leiden tot een mechanische verschuiving van de sonde in de hersenen. Daarom is het niet een triviale taak om een implanteerbare optische vezel te combineren met conventionele Microdrive-arrays.
Om bovengenoemde redenen zijn onderzoekers verplicht om de selectie van het type elektrode te optimaliseren of om een optische vezel te implanteren, afhankelijk van het doel van de opname. Tetrodes worden bijvoorbeeld gebruikt om een hogere eenheids opbrengst te bereiken in Hippocampus1,13, terwijl silicium sondes worden gebruikt om het laminaire diepte Profiel van corticale gebieden te onderzoeken, zoals de mediale entorhinale cortex (MEC)37. Op dit moment werden micro drives voor gelijktijdige implantatie van tetrodes en silicium sondes gerapporteerd voor ratten5,11. Het is echter zeer uitdagend om meerdere tetrodes en silicium sondes bij muizen te implanteren vanwege het gewicht van de micro drives, beperkte ruimte op de muis, en ruimtelijke vereisten voor het ontwerpen van de Microdrive om verschillende voelers te gebruiken. Hoewel het mogelijk is om silicium sondes zonder een Microdrive te implanteren, staat deze procedure niet toe dat de sonde wordt aangepast en wordt het slagingspercentage van het herstel van silicium sonde12,38lager. Bovendien, optogenetische experimenten vereisen aanvullende overwegingen in Microdrive array ontwerp. Dit protocol demonstreert het construeren en implanteren van een Microdrive array voor chronische opnames in vrij bewegende muizen, waardoor implantatie van negen onafhankelijk instelbare tetrodes en één instelbare opto-silicium sonde mogelijk is. Deze Microdrive-array vergemakkelijkt ook optogenetische experimenten en herstel van de silicium sonde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol demonstreert het construeren en implanteren van een hybride Microdrive array die het mogelijk maakt om neurale activiteiten uit te voeren vanuit twee hersengebieden met behulp van onafhankelijke instelbare tetrodes en een silicium sonde in vrij gedragen muizen. Het toont ook optogenetische experimenten en het herstel van de silicium sonde na experimenten. Terwijl instelbare silicium sonde33 of opto-silicon probe36 implantatie eerder is aangetoond bij muizen, he…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd deels gesteund door Japan Society voor de promotie van Science Overseas Research Fellowships (HO), begiftigd geleerde programma (TK), Human Frontier Science Program (TK), Brain Research Foundation (TK), faculteits wetenschappen en technologie verwerving en Retentie programma (TK), Brain & Behavior Research Foundation (TK), en door de Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young Detective Research Grant (JY). Wij danken W. Marks voor waardevolle commentaren en suggesties tijdens de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| #00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
| #0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
| #0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
| 22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
| 23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
| 23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
| 26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
| 30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
| 3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
| 3D printer | FormLab | Form2 | |
| 5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
| aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
| conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
| customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
| customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
| dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
| dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
| Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
| drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
| electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
| epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
| eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
| fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
| fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
| gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
| ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
| headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
| impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
| mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
| optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
| Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
| ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
| silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
| silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
| silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
| silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
| silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
| silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
| skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
| standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
| super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
| surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
| Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
| tetrode wires | Sandvik | PX000004 |
Referencias
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. The Journal of Neuroscience. 16 (2), 823-835 (1996).
- Keating, J. G., Gerstein, G. L. A chronic multi-electrode microdrive for small animals. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 201-206 (2002).
- Winson, J. A compact micro-electrode assembly for recording from the freely moving rat. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 35 (2), 215-217 (1973).
- Michon, F., et al. Integration of silicon-based neural probes and micro-drive arrays for chronic recording of large populations of neurons in behaving animals. Journal of Neural Engineering. 13 (4), 046018 (2016).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Billard, M. W., Bahari, F., Kimbugwe, J., Alloway, K. D., Gluckman, B. J. The systemDrive: a Multisite, Multiregion Microdrive with Independent Drive Axis Angling for Chronic Multimodal Systems Neuroscience Recordings in Freely Behaving Animals. eNeuro. 5 (6), (2018).
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
- Lu, P. L., et al. Microdrive with Two Independent Moveable Sets for Wide-Ranging, Multi-Site, Multi-Channel Brain Recordings. Journal of Medical and Biological Engineering. 34 (4), 341-346 (2014).
- Haiss, F., Butovas, S. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
- Headley, D. B., DeLucca, M. V., Haufler, D., Pare, D. Incorporating 3D-printing technology in the design of head-caps and electrode drives for recording neurons in multiple brain regions. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2721-2732 (2015).
- Voigts, J., Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: an ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 8 (2013).
- Yamamoto, J., Tonegawa, S. Direct Medial Entorhinal Cortex Input to Hippocampal CA1 Is Crucial for Extended Quiet Awake Replay. Neuron. 96 (1), 217-227 (2017).
- Schomburg, E. W., et al. Theta phase segregation of input-specific gamma patterns in entorhinal-hippocampal networks. Neuron. 84 (2), 470-485 (2014).
- Fernandez-Ruiz, A., et al. Entorhinal-CA3 Dual-Input Control of Spike Timing in the Hippocampus by Theta-Gamma Coupling. Neuron. 93 (5), 1213-1226 (2017).
- Rey, H. G., Pedreira, C., Quian Quiroga, R. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119 (Pt B), 106-117 (2015).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. Journal of Neuroscience Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
- Lu, L., Popeney, B., Dickman, J. D., Angelaki, D. E. Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321 (5894), 1322-1327 (2008).
- Gauthier, J. L., Tank, D. W. A Dedicated Population for Reward Coding in the Hippocampus. Neuron. 99 (1), 179-193 (2018).
- Davidson, T. J., Kloosterman, F., Wilson, M. A. Hippocampal replay of extended experience. Neuron. 63 (4), 497-507 (2009).
- Gerwinn, S., Macke, J., Bethge, M. Bayesian population decoding of spiking neurons. Frontiers in Computational Neuroscience. 3, 21 (2009).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. Journal of Neurophysiology. 90 (2), 1314-1323 (2003).
- Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165-1174 (2016).
- Hilgen, G., et al. Unsupervised Spike Sorting for Large-Scale, High-Density Multielectrode Arrays. Cell Reports. 18 (10), 2521-2532 (2017).
- Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
- Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001 (2017).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations. Cell. 157 (4), 845-857 (2014).
- Rangel Guerrero, D. K., Donnett, J. G., Csicsvari, J., Kovacs, K. A. Tetrode Recording from the Hippocampus of Behaving Mice Coupled with Four-Point-Irradiation Closed-Loop Optogenetics: A Technique to Study the Contribution of Hippocampal SWR Events to Learning. eNeuro. 5 (4), (2018).
- Liang, L., et al. Integrated and Quick-to-Assemble (SLIQ) Hyperdrives for Functional Circuit Dissection. Frontiers in Neural Circuits. 11, 8 (2017).
- Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Scientific Reports. 7 (1), 2773 (2017).
- Quilichini, P., Sirota, A., Buzsaki, G. Intrinsic circuit organization and theta-gamma oscillation dynamics in the entorhinal cortex of the rat. The Journal of Neuroscience. 30 (33), 11128-11142 (2010).
- Sauer, J. F., Struber, M., Bartos, M. Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Shikano, Y., Sasaki, T., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. Journal of Visualized Experiments. 91 (91), e51675 (2014).
- Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal cortex layer III input to the hippocampus is crucial for temporal association memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. The European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 92-100 (2018).
- Jones, M. W., Wilson, M. A. Theta rhythms coordinate hippocampal-prefrontal interactions in a spatial memory task. PLoS Biology. 3 (12), e402 (2005).
- Frank, L. M., Brown, E. N., Wilson, M. A. A comparison of the firing properties of putative excitatory and inhibitory neurons from CA1 and the entorhinal cortex. Journal of Neurophysiology. 86 (4), 2029-2040 (2001).
- Kitamura, T., et al. Eng and circuits crucial for systems consolidation of a memory. Science. 356 (6333), 73-78 (2017).
- McGaugh, J. L., Cahill, L., Roozendaal, B. Involvement of the amygdala in memory storage: interaction with other brain systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13508-13514 (1996).
- Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304 (5672), 881-883 (2004).
- Mikulovic, S., et al. On the photovoltaic effect in local field potential recordings. Neurophotonics. 3 (1), 015002 (2016).
- Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Meng, E., Hoang, T. MEMS-enabled implantable drug infusion pumps for laboratory animal research, preclinical, and clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (14), 1628-1638 (2012).
- Hu, S., et al. Dietary Fat, but Not Protein or Carbohydrate, Regulates Energy Intake and Causes Adiposity in Mice. Cell Metabolism. 28 (3), 415-431 (2018).
- Yang, Y., Smith, D. L., Keating, K. D., Allison, D. B., Nagy, T. R. Variations in body weight, food intake and body composition after long-term high-fat diet feeding in C57BL/6J mice. Obesity. 22 (10), 2147-2155 (2014).
- Morton, D. B., et al. Refinements in telemetry procedures. Seventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement, Part A. Laboratory Animals. 37 (4), 261-299 (2003).
- Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
- Lin, L., et al. Large-scale neural ensemble recording in the brains of freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 28-38 (2006).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Gaskill, B. N., Karas, A. Z., Garner, J. P., Pritchett-Corning, K. R. Nest building as an indicator of health and welfare in laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (82), 51012 (2013).
