Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

Myosins são transdutores de energia Mecanoquímica que hidrolisam trifosfato de adenosina (ATP) para gerar movimento direcional ao longo dos filamentos do citoesqueleto de actina em eucariontes^1,2. Eles têm tanto estruturalmente e kineticamente adaptados às suas várias funções intracelulares, como o transporte de organelas, contração muscular ou a geração de tensão citoesquelética^1,2. A superfamília da miosina é representada por ~ 40 genes de miosina pertencentes a ~ 12 classes distintas de miosina no genoma humano^3,4. Os membros das classes de miosina desempenham vários papéis em um conjunto altamente diversificado de distúrbios, como vários cânceres, distúrbios neurológicos, miopatias esqueléticas e cardiomiopatia hipertrófica^5,6. Dado o grande número de funções fisiológicas e patológicas destes motores moleculares, não é surpreendente que eles estão se tornando cada vez mais reconhecidos como alvos de drogas para uma variedade de condições⁷. Avanços significativos foram feitos recentemente na descoberta de novos inibidores da miosina^8,9,10 e ativadores¹¹, e para melhorar as propriedades dos já existentes^{12, 13} anos de ^{, 14} anos de ^{, quinze anos}.

A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH)-acoplado ATPase ensaio tem sido usado para medir a atividade ATPase de várias enzimas, tais como o retículo sarcoplasmático CA^{2 +} bomba ATPase¹⁶, o reparo de DNA ATPase RAD54¹⁷, o AAA + ATPase p97¹⁸ ou o motor microtúnica cinesina¹⁹. O ensaio emprega um ciclo de regeneração ATP. O difosfato de adenosina (ADP) gerado pela ATPase é regenerado para ATP por piruvato quinase (PK), que transforma uma molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) em piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH). Isso, por sua vez, oxida uma molécula de NADH a NAD. Portanto, a diminuição da concentração de NADH em função do tempo é igual à taxa de hidrólise do ATP. O ciclo de regeneração ATP mantém a concentração de ATP quase constante e a concentração de ADP baixa, contanto que PEP esteja disponível. Isso resulta em cursos de tempo linear, tornando simples determinar as taxas de reação inicial e ajuda a evitar a inibição do produto pela ADP¹⁹. Embora o ensaio ATPase acoplado ao NADH já tenha sido adaptado a um formato 96-bem²⁰, os volumes de alta reação (~ 150 μL) tornam-se relativamente dispendiosos devido à alta demanda de reagentes, tornando-o menos adequado à rápida triagem de um grande número de Compostos. Métodos alternativos, como o ensaio verde de Malaquita^19,21, que depende da detecção do fosfato produzido pela enzima ATPase, foram comprovados mais adequados para miniaturização e triagem de alta produtividade^{22 , 23} anos de ^{, 24}. no entanto, um ensaio de ponto final é mais susceptível de ser afectado por vários artefactos (discutidos abaixo), que podem continuar a não ser descobertos na ausência de cursos a tempo inteiro.

Aqui, o ensaio ATPase acoplado à NADH foi otimizado para triagem de produção semialta de inibidores de pequenas moléculas. O músculo esquelético e cardíaco miosina II e os inibidores da miosina blebbistatina⁸ , para-aminoblebbistatin¹³ e para-nitroblebbistatin¹² são utilizados para demonstrar o poder do ensaio, que se baseia na NADH fluorescência como uma leitura. Este protocolo é capaz de triagem de projetos focados em qualquer ADP produzindo enzimas.