Aislamiento de subconjuntos de macrófagos y células estromas de especímenes miocárgonos humanos y de ratón

Los macrófagos representan el tipo de células inmunitarias más abundante en el corazón, y desempeñan un papel importante en la generación de respuestas inflamatorias y reparativas robustas después de una lesión cardíaca^1,2,3,4. Anteriormente, nuestro grupo identificaba dos subconjuntos principales de macrófagos en el corazón murino derivados de orígenes de desarrollo distintos^5,6. En términos generales, se pueden identificar poblaciones distintas de subconjuntos de macrófagos cardíacos residentes en tejidos en función de la expresión de la superficie celular de CCR2 (receptor de quimioquina con motivo C-C 2). CCR2^– los macrófagos (expresión de la superficie celular: CCR2^–MHCII^low y CCR2^–MHCII^high)son de origen embrionario (linajes primitivos y eritromieloides), capaces de autorenovarse y representar a una población dominante en condiciones homeostáticas. Los macrófagos residentes CCR2⁺ son de origen hematopoyético definitivo, se mantienen a través del reclutamiento de monocitos circulantes y representan a una población menor en condiciones homeostáticas. Funcionalmente, CCR2^– los macrófagos generan una inflamación mínima y son críticos para el desarrollo coronario de regeneración cardíaca neonatal^5,7. Por el contrario, CCR2⁺ macrófagos inician respuestas inflamatorias robustas después de insultos cardíacos y contribuyen a la lesión colateral de cardiomiocitos, la remodelación adversa del ventrículo izquierdo, y la progresión de la insuficiencia cardíaca^8,9.

Recientemente, hemos demostrado que el miocardio humano también contiene dos subconjuntos distintos de macrófagos identificados de manera similar como CCR2^– o CCR2⁺⁸. La expresión génica y los análisis funcionales revelaron que los macrófagos ccr2^{humanos –} y CCR2⁺ representan subconjuntos funcionalmente divergentes y son funcionalmente análogos a CCR2^– y los macrófagos CCR2⁺ que se encuentran en el corazón del ratón. CCR2 humano^– los macrófagos expresan niveles robustos de factores de crecimiento, incluyendo IGF1, PDGF, Cyr61, y HB-EGF. CCR2⁺ macrófagos se enriquecen en quimioquinas y citoquinas que promueven la inflamación, como IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7, y TNF-a. Los macrófagos estimulados CCR2⁺ macrófagos secretan niveles notablemente más altos de la interleucina de citoquina inflamatoria-1o (IL-1o) en cultivo. La forma en que estos subconjuntos contribuyen diferencialmente a la reparación de tejidos y a la remodelación del ventular izquierdo (LV) en el contexto de una lesión cardíaca sigue siendo un área de investigación activa.

El análisis basado en citometría de flujo de la heterogeneidad de macrófagos en el ratón y el corazón humano requiere digerir el tejido cardíaco y generar una suspensión de una sola célula seguida de un análisis citométrico de flujo o clasificación celular para otros procesos aguas abajo, como la secuenciación masiva de ARN/secuenciación de ARN de una sola célula o el cultivo de las células para ensayos funcionales. El protocolo original para hacer una suspensión de una sola célula de corazones murinos fue reportado por primera vez por el grupo Nahrendorf en Nahrendorf et al. 2007¹⁰. Nuestro laboratorio ha adaptado y modificado el protocolo para extraer macrófagos del miocardio humano. Usando el mismo protocolo pero con ligera modificación en el esquema de tinción y gating, CD45^– células estromales del miocardio humano también se pueden cosechar. Aquí se presenta, en texto y vídeo, un protocolo que se realiza rutinariamente para la extracción de macrófagos o estromatos del miocardio humano.

Las muestras de tejido cardíaco se obtienen de pacientes adultos con cardiomiopatía dilatada (DCM: idiopática o familiar) o cardiomiopatía isquémica (MIC) sometidos a implantación de dispositivode asistencia ventricular izquierda (LVAD) o trasplante cardíaco. Los corazones explantados o los núcleos LVAD se perfunden intravascularmente con salina fría antes de iniciar el procedimiento de digestión. Es importante tener en cuenta que la “calidad” de la muestra de tejido determinada en términos de grado de cicatrización o infiltración de tejido adiposo puede afectar en gran medida el rendimiento de los macrófagos. Los especímenes cardíacos con grandes áreas de cicatrización tendrán un rendimiento celular mucho menor y pueden plantear una limitación técnica grave cuando los métodos de análisis aguas abajo deseados requieren el cultivo celular in vitro.