توصيف الناقلات غشاء بواسطة تعبير مغاير في كولاي وإنتاج الحويصلات الغشائية
Summary
نحن وصف طريقه لتوصيف ناقلات الغشاء التي يحركها البروتون في الاستعدادات غشاء الحويصلة التي تنتجها التعبير المغاير في كولاي تحلل من الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية.
Abstract
وقد تم تطوير العديد من الطرق لتوصيف وظيفيا ناقلات غشاء الرواية. بوليامينيس في كل مكان في جميع الكائنات الحية ، ولكن لم يتم التعرف علي مبادلات بوليامين في النباتات. هنا ، ونحن الخطوط العريضة طريقه لتوصيف الحمالين بوليامين باستخدام الحويصلات الغشاء المتولدة من تحلل من الخلايا القولونية اساشيكوجيا التعبير عن انتيبورتر النبات. أولا ، ونحن عبرت بشكل غير متجانس AtBAT1 في سلاله e. القولونية ناقصه في بوليامين والناقلون الصرف ارجينين. وأنتجت الحويصلات باستخدام الصحافة الفرنسية ، وتنقيتها من قبل نبذ حلول واستخدامها في فحص غشاء الترشيح من الركائز المسمية لإظهار خصوصية الركيزة للناقل. وأظهرت هذه المقايسات ان AtBAT1 هو نقل بوساطة البروتون من ارجينين, حمض γ الامينيه (GABA), بوتريسين و spermidine. سلاله متحولة التي تم تطويرها لفحص AtBAT1 قد تكون مفيده للتحليل الوظيفي لأسر أخرى من المبادلات النباتية والحيوانية بوليامين. ونحن نفترض أيضا ان هذا النهج يمكن استخدامها لتوصيف العديد من أنواع أخرى من مضادات الحمالين ، طالما يمكن التعبير عن هذه البروتينات في غشاء الخلية البكتيرية. E. القولونية هو نظام جيد لتوصيف ناقلات الرواية ، لان هناك طرق متعددة التي يمكن استخدامها لطفرة الناقلات الاصليه.
Introduction
البروتينات المتورطة في الاتجار بالأيض تشكل مستوي أساسيا من التنظيم الفسيولوجي ، ولكن الغالبية العظمي من ناقلات الغشاء النباتي لم تتميز بعد وظيفيا. وقد نفذت عده استراتيجيات لتوصيف بروتينات النقل الجديدة. وقد استخدمت التعابير غير المتجانسة في الكائنات الحية النموذجية مثل الخلايا القولونية والنواة الحقيقية مثل الخميرة والبويضات xenopus وخلايا الثدييات وخلايا الحشرات والخلايا النباتية لتحديد نشاط النقل1. ويفضل الخلايا ذات النواة الحقيقية للتعبير عن البروتينات النواة ، لان التركيب الخلوي الأساسي ، ومسارات تحويل الإشارات ، والنسخ والترجمة أليات متوافقة مع الظروف الاصليه.
كانت الخميرة كائنا نموذجيا هاما لتوصيف بروتينات النقل الجديدة في النباتات. أول البروتين النقل النباتي الذي تم التعبير عنه بنجاح في الخميرة (ساكاروميسز pombe) كان الناقل هيكسوز HUP1 من شلوريلا2. ومنذ ذلك الحين ، والعديد من البروتينات نقل النبات تتميز وظيفيا باستخدام نظام التعبير الخميرة. وتشمل هذه المعدات ناقلات السكر النباتية (SUC1 و SUC23و VfSUT1 و VfSTP14) وناقلات اوكاين (الAUX1 والدبوس5). مساوئ استخدام الخميرة للتعبير عن البروتينات النباتية يمكن ان تشمل ضعف النشاط من البروتينات المترجمة plastid لان الخميرة تفتقر إلى هذا organelle ، ثمة6، وتشكيل المجاميع المضللة وتفعيل الاستجابات الإجهاد في الخميرة بسبب الإفراط في التعبير عن البروتينات غشاء7،8،9.
التعبير المغاير للبروتينات النقل في البويضات Xenopus وقد استخدمت علي نطاق واسع لتوصيف إلكتروفيزيولوجي للناقلات10. وكانت أول البروتينات النقل النباتية التي تتميز باستخدام التعبير المغاير في البويضات Xenopus Arabidopsis قناه البوتاسيوم KAT110 وناقل Arabidopsis هيكز STP111. ومنذ ذلك الحين ، وقد استخدمت البويضات Xenopus لتوصيف العديد من البروتينات النقل النباتية مثل البلازما الناقلات غشاء12، فاكولار السكروز الناقل SUT413 و فاكولار مالات الناقل ALMT914. ومن القيود الهامه علي البويضات Xenopus لاختبارات النقل ان تركيز الأيض داخل الخلايا لا يمكن التلاعب1. وعلاوة علي ذلك ، مطلوب المعرفة المهنية لاعداد البويضات Xenopus وتنوع دفعات البويضة من الصعب السيطرة عليها.
التعبير المغاير في الكائن الحي النموذجي e. كولاي هو نظام مثالي من حيث توصيف البروتينات الجديدة لنقل النباتات. مع الجينوم متسلسلة تماما15، والخصائص الجزيئية والفسيولوجية لل e. القولونية معروفه جيدا. أسست أدوات جزيئيه وتقنيات جيدا16. الاضافه إلى ذلك ، مختلفه ناقلات التعبير ، سلالات غير المسببة للامراض والمسوخ متاحه17،18،19. وعلاوة علي ذلك ، e. كولاي لديها معدل نمو مرتفع ويمكن زراعتها بسهوله في ظل ظروف المختبر. يمكن التعبير عن العديد من البروتينات بسهوله وتنقيتها بكميات عاليه في e. كولاي9. عندما لا يمكن ان تكون البروتينات التهاوي مباشره في النظم الخلوية ، وأعاده تكوين البروتينات في الجسيمات الشحمية كان أيضا ناجحه ، وان كانت تحديا الابتكار لتوصيف البروتينات الغشاء المنقي. وقد تم إنجاز توصيف وظيفي للبروتينات النقل الميتوكوندريا النبات بما في ذلك الناقلات مذاب مثل ناقلات الفوسفات في فول الصويا والذرة والأرز والArabidopsis ، dicarboxylate-tricarboxylate الناقل في Arabidopsis باستخدام هذا النظام نموذج20،21. ومع ذلك ، تم العثور علي البروتينات المؤتلف من بروتين الطماطم SICAT9 لتكون غير وظيفية في تجارب أعاده التشكيل ، والأعضاء الآخرين من الاسره الناقل CAT وجدت لتكون غير وظيفية في اختبارات البويضات Xenopus 22. التالي ، هناك حاجه إلى أدوات جزيئيه اضافيه لتوصيف ناقلات الغشاء.
تم العثور علي خمسه أنظمه النقل بولياميني في e. كولاي23. وهي تشمل اثنين من الناقلين ABC التوسط في امتصاص سبيرمدين والوضع ، ومبادل النبات/اورنيثين ، ومبادل cadaverine/يسين ، ومصدر سبيرمدين والمستورد بوسكارين. وقد اتسمت في الأصل مبادل بوتريسين PotE باستخدام فحص حويصلة ، حيث تم اعداد الحويصلات الداخلية من قبل الخلايا الليسينجه مع الصحافة الفرنسية وقياس امتصاص بوتريمين الشعاعية في الحويصلات في مقابل اورنيثين24. واستخدمت اختبارات الحويصلة أيضا لتوصيف ناقل الكالسيوم ، الذي توسط في نقل الكالسيوم ردا علي التدرج البروتون25. وقد دفعتنا هذه التجارب إلى وضع استراتيجية لتوصيف مبادلات البوليامين الأخرى. انشانا لأول مره سلاله من e. القولونية ناقصه في pote والمبادلات cadb . هنا ، فاننا نظهر التوصيف الوظيفي لمصنع بوليامين انتيبورتر عن طريق التعبير غير المتجانس في سلاله e. القولونية المعدلة ، وتوليد الحويصلات الغشائية باستخدام الصحافة الفرنسية ، والمقايسات الشعاعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، ونحن الخطوط العريضة طريقه لتوصيف انتيبورتر عن طريق التعبير أولا عن البروتين في كولاي ومن ثم توليد الحويصلات الغشائية ، بحيث يمكن ان يكون البروتين المعرب عنها بشكل غير متجانس في نظام خاليه من الخلايا. الاضافه إلى المعدات الموجودة في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية ،…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وجاء الدعم لهذا المشروع من كليه الدراسات العليا BGSU ، ومكتب BGSU من البرامج والبحوث التي ترعاها.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3H-putrescine | PerkinElmer | NET185001MC | |
| 3H-spermidine | PerkinElmer | NET522001MC | |
| 4-chloro-1-naphthol | Sigma-Aldrich | C8890 | |
| 14C arginine | Moravek Inc. | MC137 | |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A-5006 | |
| Anti-His (C-term)-HRP antibody | ThermoFisher | R931-25 | Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher | 23227 | Pierce BCA protein asay kit. |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 161-0404 | |
| Carboxypeptidase B | Sigma-Aldrich | C9584-1mg | |
| Centrifuge | Sorvall | SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor | |
| Dounce tissue grinder | LabGenome | 7777-7 | Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout. |
| Ecoscint-H | National Diagnostics | LS275 | scintillation cocktail |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Filtration manifold | Hoefer | FH225V | |
| French Pressure Cell | Glen Mills | FA-080A120 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G6904 | |
| Glycerol | |||
| GraphPad Prism software | http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm | ||
| Hydrogen peroxide | KROGER | ||
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Liquid scintillation counter | Beckman | LS-6500 | |
| Maleate | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ||
| Nitrocellulose membrane filters | Merck Millipore | hawp02500 | 0.45 µM |
| PCR clean up kit | Genscript | QuickClean II | |
| Potassium Phosphate dibasic | ThermoFisher | P290-500 | |
| putrescine | fluka | 32810 | |
| Potassium Phosphate monobasic | J.T.Baker | 4008 | |
| Spermidine | Sigma-aldrich | S2501 | |
| Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 | This manuscript | Available upon request. | Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers. |
| Tris-base | Research Products | T60040-1000 | |
| Ultracentrifuge | Sorvall MTX 150 | 46960 | Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor |
| Ultracentrifuge tubes | ThermoFisher | 45237 | Centrifuge tubes for S150-AT rotor |
| Vector: pBAD-DEST49 | ThermoFisher | Gateway expression vector for E. coli |
Referencias
- Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
- Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
- Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker’s yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
- Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
- Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
- Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
- Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
- Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
- Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
- Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
- Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
- Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
- Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
- Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
- Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
- Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
- Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
- Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
- Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
- . P1vir phage transduction Available from: https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011)
- . pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010)
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a laboratory Manual. , (2012).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
- . GaphPad Software Available from: https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019)
- Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
- Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
- Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
- Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
- Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
- Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
- LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
- Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
- Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).
