Övervakning av GPCR-β-arrestin1/2 interaktioner i real tid levande system för att påskynda Drug discovery
Summary
Interaktioner med GPCR-β-arrestin är ett framväxande fält i GPCR Drug discovery. Noggrann, exakt och enkel att ställa in metoder är nödvändiga för att övervaka sådana interaktioner i levande system. Vi visar en strukturell kompletterings analys för att övervaka interaktioner med GPCR-β-arrestin i levande celler i realtid, och den kan utökas till alla GPCR.
Abstract
Interaktioner mellan G-proteinkopplade receptorer (GPCRs) och β-arrestiner är vitala processer med fysiologiska implikationer av stor betydelse. För närvarande är karaktäriseringen av nya läkemedel mot deras interaktioner med β-arrestins och andra cytosoliska proteiner oerhört värdefull inom området GPCR Drug discovery särskilt under studiet av GPCR partisk agonism. Här visar vi tillämpningen av en ny strukturell kompletterings analys för att korrekt övervaka receptor-β-arrestin interaktioner i realtid levande system. Denna metod är enkel, noggrann och kan lätt utvidgas till någon GPCR av intresse och även den har den fördelen att den övervinner ospecifika interaktioner på grund av närvaron av en låg uttryck promotor närvarande i varje vektorsystem. Detta strukturella komplement analys ger viktiga funktioner som möjliggör en noggrann och exakt övervakning av receptor-β-arrestin interaktioner, vilket gör det lämpligt i studien av partisk vid av alla GPCR system samt GPCR c-Terminus ‘ fosforylering koder skrivna av olika GPCR-kinaser (GRKs) och post-translationella modifieringar av arrestins som stabiliserar eller destabilisera receptorn-β-arrestin Complex.
Introduction
Gpcrs representerar målet på nästan 35% av nuvarande läkemedel på marknaden1,2 och en klar förståelse av deras farmakologi är avgörande för utvecklingen av nya terapeutiska läkemedel3. En av de viktigaste aspekterna i GPCR Drug discovery, särskilt under utvecklingen av partiska agonister är karakterisering av nya ligander mot receptor-β-arrestin interaktioner4 och β-arrestin interaktioner med andra cytosoliska proteiner som proteinet5.
Det har dokumenterats att β-arrestin beroende signalering spelar en nyckelroll i neurologiska sjukdomar såsom bipolär sjukdom, stor depression, och schizofreni6 och även allvarliga biverkningar i vissa mediciner såsom morfin7.
Nuvarande metoder som används för att övervaka dessa interaktioner vanligtvis inte representerar faktiska endogena nivåer av proteinerna i studien, i vissa fall de visar svag signal, photoblekning och beroende på GPCR kan det vara tekniskt utmanande att ställa in8. Denna nya strukturella komplessionstest analys använder låg uttryck promotorn vektorer för att efterlikna endogena fysiologiska nivåer och ger hög känslighet jämfört med nuvarande metoder9. Med detta tillvägagångssätt var det möjligt att enkelt karakterisera galanin receptor-β-arrestin1/2 och även β-arrestin2-clathrin interaktioner10. Denna metod kan användas i stor utsträckning för alla GPCR av särskilt intresse där β-arrestins spelar en viktig fysiologisk funktion eller deras signalering är relevant i vissa sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med hjälp av den metod som presenteras här, interaktioner mellan alla GPCR och β-arrestin1/2 kan övervakas i realtid levande system med hjälp av denna GPCR-β-arrestin strukturella komplement analys. I detta avseende kunde vi konstatera differential β-arrestin rekrytering mellan de två β-arrestin isoformerna av GLP-1R (en prototypisk klass B GPCR), observerade vi också en dissociation av receptorn-β-arrestin komplexa några minuter efter att ha nått den maximala självlysande signalen.
<p class="jove_conte…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från forskningsprogrammet (NRF-2015M3A9E7029172) av Koreas nationella forskningsstiftelse (NRF) finansierat av ministeriet för vetenskap, IKT och framtidsplanering.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
Referencias
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. . Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).
- Life Biomedical. . HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).
- New England BioLabs. . Ligation Calculator. , (2019).
- . . Cosmo Genetech. , (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. . NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
