Overvågning af GPCR-β-arrestin1/2 interaktioner i realtid levende systemer til at fremskynde Drug Discovery
Summary
GPCR-β-arrestin interaktioner er et spirende felt i GPCR Drug Discovery. Nøjagtige, præcise og nemme at opsætte metoder er nødvendige for at overvåge sådanne interaktioner i levende systemer. Vi viser en strukturel komplementation assay til at overvåge GPCR-β-arrestin interaktioner i realtid levende celler, og det kan udvides til enhver GPCR.
Abstract
Interaktioner mellem G-protein koblede receptorer (GPCRs) og β-arrestins er vitale processer med fysiologiske konsekvenser af stor betydning. I øjeblikket, karakterisering af nye lægemidler mod deres interaktion med β-arrestins og andre cytosolisk proteiner er yderst værdifuld inden for GPCR Drug Discovery især under studiet af GPCR partisk agonisme. Her viser vi anvendelsen af en ny strukturel komplementation assay til præcist at overvåge receptor-β-arrestin interaktioner i realtid levende systemer. Denne metode er enkel, præcis og kan nemt udvides til enhver GPCR af interesse, og det har også den fordel, at det overvinder uspecifikke interaktioner på grund af tilstedeværelsen af en lav ekspressions promotor til stede i hvert vektorsystem. Denne strukturelle komplementerings analyse giver nøglefunktioner, der muliggør en nøjagtig og præcis monitorering af receptor-β-arrestin-interaktioner, hvilket gør den velegnet i studiet af partisk agonisme af ethvert GPCR-system samt GPCR c-Terminus ‘ fosforylering koder ‘ skrevet af forskellige GPCR-kinaser (GRKs) og post-translationelle modifikationer af arrestins, der stabiliserer eller destabiliserer receptor-β-arrestin-komplekset.
Introduction
Gpcrs repræsenterer målet på næsten 35% af de nuværende stoffer på markedet1,2 og en klar forståelse af deres farmakologi er afgørende i udviklingen af nye terapeutiske stoffer3. Et af de vigtigste aspekter i GPCR Drug Discovery, især under udviklingen af partiske agonister er karakteriseringen af nye ligander mod receptor-β-arrestin interaktioner4 og β-arrestin interaktioner med andre cytosolisk proteiner såsom som clathrin5.
Det er blevet dokumenteret, at β-arrestin afhængig signalering spiller en central rolle i neurologiske lidelser såsom bipolar lidelse, svær depression, og skizofreni6 og også alvorlige bivirkninger i nogle medikamenter såsom morfin7.
Nuværende metoder, der anvendes til at overvåge disse interaktioner normalt ikke repræsenterer faktiske endogene niveauer af proteiner i studiet, i nogle tilfælde viser de svage signal, foto blegning og afhængigt af GPCR det kan være teknisk udfordrende at oprette8. Denne nye strukturelle komplementation analyse bruger lav ekspression promotorer vektorer for at efterligne endogene fysiologiske niveauer og giver høj følsomhed i forhold til de nuværende metoder9. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, det var muligt at nemt karakterisere Galanin receptor-β-arrestin1/2 og også β-arrestin2-clathrin interaktioner10. Denne metode kan anvendes bredt til enhver GPCR af særlig interesse, hvor β-arrestins spiller en vigtig fysiologisk funktion, eller deres signalering er relevant i nogle sygdomme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, kan interaktioner mellem GPCR og β-arrestin1/2 overvåges i realtids levende systemer ved hjælp af denne GPCR-β-arrestin strukturel komplementerings analyse. I denne henseende var vi i stand til at observere differentialet β-arrestin rekruttering mellem de to β-arrestin isoformer af GLP-1r (en prototypiske klasse B GPCR), vi også observeret en dissociation af receptor-β-arrestin kompleks et par minutter efter at have nået den maksimale lysende signal.
<p class="…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra forskningsprogrammet (NRF-2015M3A9E7029172) fra det nationale forskningsinstitut i Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT og fremtidig planlægning.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
Referencias
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. . Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).
- Life Biomedical. . HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).
- New England BioLabs. . Ligation Calculator. , (2019).
- . . Cosmo Genetech. , (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. . NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
