Monitoreo de las interacciones de GPCR--arrestin1/2 en sistemas de vida en tiempo real para acelerar el descubrimiento de fármacos
Summary
Las interacciones de gpCR-arrestin son un campo emergente en el descubrimiento de fármacos GPCR. Se utilizan métodos precisos, precisos y fáciles de configurar para supervisar dichas interacciones en los sistemas vivos. Mostramos un ensayo de complemento estructural para monitorear las interacciones de la captura de GPCR en células vivas en tiempo real, y se puede extender a cualquier GPCR.
Abstract
Las interacciones entre los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) y las arrestinas son procesos vitales con implicaciones fisiológicas de gran importancia. En la actualidad, la caracterización de nuevos fármacos hacia sus interacciones con las arrestinas y otras proteínas citosólicas es extremadamente valiosa en el campo del descubrimiento de fármacos GPCR, especialmente durante el estudio del agonismo sesgado GPCR. Aquí, mostramos la aplicación de un nuevo ensayo de complementación estructural para monitorear con precisión las interacciones de receptores–arrestin en sistemas vivos en tiempo real. Este método es simple, preciso y se puede extender fácilmente a cualquier GPCR de interés y también tiene la ventaja de que supera interacciones inespecíficas debido a la presencia de un promotor de baja expresión presente en cada sistema vectorial. Este ensayo de complemento estructural proporciona características clave que permiten un seguimiento preciso y preciso de las interacciones entre receptores y arrestina, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la “fosforilación” de GPCR c-terminus, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la c-terminusción GPCR códigos’ escritos por diferentes GPCR-kinases (GRKs) y modificaciones post-traduccionales de arrestinas que estabilizan o desestabilizan el complejo de receptores-arrestina.
Introduction
Los GPCR representan el objetivo de casi el 35% de los fármacos actuales en el mercado1,2 y una comprensión clara de su farmacología es crucial en el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos3. Uno de los aspectos clave en el descubrimiento de fármacos GPCR, particularmente durante el desarrollo de agonistas sesgados es la caracterización de nuevos ligandos hacia las interacciones entre receptores y arrestinas4 y las interacciones de arrestina con otras proteínas citosólicas, tales como como clathrin5.
Se ha documentado que la señalización dependiente de la arrestina desempeña un papel clave en los trastornos neurológicos como el trastorno bipolar, la depresión mayor y la esquizofrenia6 y también los efectos secundarios graves en algunos medicamentos como la morfina7.
Los métodos actuales utilizados para monitorear estas interacciones generalmente no representan los niveles endógenos reales de las proteínas en estudio, en algunos casos muestran señal débil, fotoblanqueo y dependiendo del GPCR podría ser técnicamente difícil configurar8. Este novedoso ensayo de complementación estructural utiliza vectores promotores de baja expresiónpara imitar los niveles fisiológicos endógenos y proporciona una alta sensibilidad en comparación con los métodos actuales 9. Usando este enfoque, fue posible caracterizar fácilmente las interacciones de Galanin receptor—arrestin1/2 y también de la arlatina10. Esta metodología puede ser ampliamente utilizada para cualquier GPCR de particular interés donde las arrestinas juegan una función fisiológica clave o su señalización es relevante en algunas enfermedades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando el método que se presenta aquí, las interacciones entre cualquier GPCR y el valor 1/2 se pueden monitorear en sistemas vivos en tiempo real utilizando este ensayo de complementación estructural de GPCR–arrestin. En este sentido, pudimos observar el reclutamiento diferencial de arrestina entre las dos isoformas de arrestina por el GLP-1r (Un prototípico clase B GPCR), también observamos una disociación del complejo del receptor—arrestin a los pocos minutos después de alcanzar el máximo señal luminiscent…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación (NRF- 2015M3A9E7029172) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
Referencias
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